Ang Giardia duodenum kay usa ka parasitic nga organismo nga maoy hinungdan sa giardiasis, usa ka intestinal infection ilabina kasagaran sa mga gagmayng bata nga adunay clinical signs sa diarrhea.Gitaho na namo kaniadto nga ang extracellular G. duodenalis nag-aghat sa pagpaaktibo sa intracellular oligomerization-like receptor 3 (NLRP3) nga nagbugkos sa mga nucleotides ug nag-regulate sa host inflammatory responses pinaagi sa extracellular vesicle (EV) secretion.Bisan pa, ang eksakto nga molekula nga mga pattern sa pathogen-associated duodenococcal EV (GEV) nga nalambigit niini nga proseso ug ang papel sa NLRP3 inflammasome sa giardiasis nagpabilin nga matin-aw.
Ang recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ug alpha-7.3 giardins sa GEV gitukod, gibalhin ngadto sa mouse primary peritoneal macrophage, ug namatikdan pinaagi sa pagsukod sa target sa panghubag nga molekula nga caspase-1.Ang lebel sa ekspresyon sa p20 gisusi..Ang G. duodenalis alpha-2 ug alpha-7.3 giardines orihinal nga giila pinaagi sa pagsukod sa NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 ug caspase-1 p20), IL secretion.1β nga lebel, apoptotic spotted protein (ASC) oligomerization nga lebel, ug immunofluorescent localization sa NLRP3 ug ASC.Ang papel sa NLRP3 inflammasome sa pathogenicity sa G. duodenalis dayon gi-assess gamit ang mga ilaga diin ang NLRP3 activation gibabagan (NLRP3 blocked mice) ug pathological nga mga kausaban sa gibug-aton sa lawas, duodenal parasitic load, ug duodenal tissue gimonitor.Dugang pa, among gisusi kung ang hiardines alpha-2 ug alpha-7.3 nag-aghat sa pagtago sa IL-1β sa vivo pinaagi sa NLRP3 inflammasome ug gitino ang papel niini nga mga molekula sa pathogenicity sa G. duodenalis sa mga ilaga.
Ang Alpha-2 ug alpha-7.3 giardines nag-aghat sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa vitro.Kini misangpot sa pagpaaktibo sa p20 caspase-1, usa ka pagtaas sa lebel sa ekspresyon sa NLRP3, pro-IL-1β, ug pro-caspase-1 nga mga protina, usa ka mahinungdanong pagtaas sa IL-1β nga pagtago, ang pagporma sa ASA spots sa cytoplasm, ug ang induction sa ASA oligomerization.Ang panghubag sa NLRP3 nga pagkawala sa penile nagpasamot sa pathogenicity sa G. duodenalis sa mga ilaga.Ang mga ilaga nga gitambalan nga adunay mga cyst pinaagi sa gavage gikan sa NLRP3-blocked nga mga ilaga nagpakita sa usa ka dugang nga gidaghanon sa mga trophozoites ug grabe nga kadaot sa duodenal villi, nga gihulagway pinaagi sa necrotic crypts uban sa shrunken ug branching.Sa vivo nga mga eksperimento nagpakita nga ang giardines alpha-2 ug alpha-7.3 makaaghat sa pagtago sa IL-1β pinaagi sa NLRP3 inflammasome, ug ang pagbakuna sa giardines alpha-2 ug alpha-7.3 makapakunhod sa pathogenicity sa G. duodenalis sa mga ilaga.
Gikuha sa tingub, ang mga resulta niini nga pagtuon nagsugyot nga giardia alpha-2 ug alpha-7.3 hinungdan upregulation sa host NLRP3 panghubag ug pagpakunhod sa infectivity sa G. duodenalis sa mga ilaga, nga nagsaad nga mga target sa pagpugong sa giardiasis.
Ang Giardia duodenum usa ka extracellular protozoan parasite nga nagpuyo sa gamay nga tinai ug hinungdan sa 280 milyon nga mga kaso sa giardiasis nga adunay diarrhea matag tuig, labi na sa mga bata sa mga nag-uswag nga mga nasud [1].Ang mga tawo nataptan pinaagi sa pag-inom sa tubig o pagkaon nga kontaminado sa M. duodenum cysts, nga unya mosulod sa tiyan ug ipagawas sa gastric juices.Giardia duodenum trophozoites motapot sa duodenal epithelium, hinungdan sa kasukaon, pagsuka, kalibanga, sakit sa tiyan, ug pagkawala sa timbang.Ang mga indibidwal nga adunay immunodeficiency ug cystic fibrosis dali nga mataptan.Ang impeksyon mahimo usab nga mahitabo pinaagi sa oral ug anal sex [2].Ang mga tambal sama sa metronidazole, tinidazole, ug nitazoxanide mao ang gipalabi nga mga kapilian sa pagtambal alang sa mga impeksyon sa duodenal [3].Bisan pa, kini nga mga tambal sa chemotherapy hinungdan sa dili maayo nga mga epekto sama sa kasukaon, carcinogenesis, ug genotoxicity [4].Busa, ang mas epektibo nga mga estratehiya kinahanglan nga maugmad aron mapugngan ang impeksyon sa G. duodenalis.
Ang mga inflammasom usa ka klase sa cytosolic protein complexes nga kabahin sa natural nga immune response, nga nagtabang sa pagpanalipod batok sa pathogen invasion ug pagpataliwala sa makapahubag nga mga tubag [5].Taliwala niini nga mga inflammasom, ang nucleotide-binding oligomerization (NOD) receptor 3 (NLRP3) nucleotide-binding oligomerization (NLRP3) nucleotide-binding-like inflammasome kay kaylap nga gitun-an tungod kay kini mamatikdan sa nagkalain-laing pathogen/damage-associated molecular patterns (PAMP). DAMP), nag-ila, nagpalihok sa natural nga immune system.ug nag-regulate sa intestinal homeostasis sa daghang mga sakit nga makapahubag [6,7,8].Kini naglangkob sa pattern recognition receptor (PRR) NLRP3, usa ka adapter apoptotic spotted protein (ASC), ug usa ka effector procaspase-1 o procaspase-11.Ang NLRP3 inflammasome naglihok isip host batok sa pathogen invasion, sumala sa naobserbahan sa Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], ug Leishmania nga mga pagtuon.[11], apan gitaho usab nga ang pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome naglimite sa pagpanalipod sa immune response ug nagpasamot sa pag-uswag sa sakit, pananglitan, sa mga ulod [12].Base sa among nangaging mga nahibal-an, among gitaho nga ang extracellular G. duodenalis nag-aghat sa intracellular activation sa NLRP3 nga panghubag ug nag-modulate sa host inflammatory nga mga tubag pinaagi sa pagtago sa mga extracellular vesicle (EVs) [13].Bisan pa, ang papel sa NLRP3 inflammasome sa impeksyon sa G. duodenalis sa vivo nagpabilin nga matino.
Giardins orihinal nga gihulagway nga structural component sa G. duodenalis cytoskeleton ug adunay importante nga papel sa trophozoite motility ug epithelial cell attachment sa gamay nga tinai.Aron mas maayo nga mopahiangay sa kalikopan ug madugangan ang ilang pathogenicity, ang G. duodenalis trophozoites nagpalambo sa usa ka talagsaon nga istruktura sa cytoskeletal nga gilangkoban sa 8 flagella, 1 tunga nga lawas, ug 1 ventral disc [14].Ang trophozoites sa Giardia duodenum naggamit sa ilang cytoskeleton aron motuhop sa ibabaw nga gamay nga tinai, ilabina sa duodenum, ug motapot sa mga enterocyte.Kanunay silang molalin ug motapot sa epithelial cells gamit ang cell metabolism.Busa, adunay suod nga relasyon tali sa ilang cytoskeleton ug virulence.Ang mga giardine nga espesipiko alang sa Giardia duodenum mga sangkap sa istruktura sa cytoskeleton [15] ug gibahin sa upat ka klase: α-, β-, γ-, ug δ-giardines.Adunay 21 ka miyembro sa pamilyang α-giardin, nga ang tanan adunay abilidad nga nagsalig sa calcium sa paggapos sa mga phospholipid [16].Gikonektar usab nila ang cytoskeleton sa cell lamad.Sa mga indibidwal nga adunay diarrhea nga gipahinabo sa G. duodenalis, ang α-giardins kaayo nga gipahayag ug immunoreactive sa panahon sa impeksyon [17].Ang heterologous nga mga bakuna nga gibase sa Giardia alfa-1 gipanalipdan batok sa giardiasis sa mga ilaga ug mga potensyal nga kandidato nga antigens alang sa pagpalambo sa bakuna [18].Ang Alpha-8 giardin, nga na-localize sa plasma membrane ug flagella, apan dili sa ventral disc, nagpalambo sa motility ug growth rate sa trophozoites sa G. duodenalis [19].Ang Alpha-14 giardin nagtapot sa mga istruktura sa microtubule sa flagella ug makaapekto sa kalagsik sa G. duodenalis [20].Ang Alpha-11 giardine anaa sa kadagaya sa tibuok nga siklo sa kinabuhi, ug ang sobrang pagpahayag sa alpha-11 giardine makadaot sa G. duodenalis mismo [21].Bisan pa, dili klaro kung ang alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine nanalipod batok sa impeksyon sa G. duodenalis ug ang ilang mga mekanismo sa ilawom.
Niini nga pagtuon, ang recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ug pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine gibalhin ngadto sa mouse primary peritoneal macrophage aron ma-activate ang host NLRP3.Ang mga target nga makapahubag dayon gisusi.Gisusi usab namo ang papel sa NLRP3 inflammasome sa pathogenicity sa G. duodenalis, gisusi kung ang alpha-2 ug alpha-7,3 giardines nag-aghat sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa vivo, ug gitino nga kining duha ka papel sa giardines sa pathogenicity sa G. duodenalis.Ang among sagad nga katuyoan mao ang pag-ugmad sa mga gisaad nga target alang sa pagpugong sa impeksyon sa G. duodenalis.
Ang ihalas nga tipo (WT) C57BL/6 nga babaye nga mga ilaga nga nag-edad 5-8 ka semana gipalit gikan sa Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, China).Ang mga ilaga adunay libre nga pag-access sa tubig, nakadawat og sterilized nga pagkaon ug gitago sa usa ka 12/12 nga oras nga kahayag / ngitngit nga siklo.Sa wala pa ang impeksyon, ang mga ilaga nakadawat og antibiotics ad libitum sa tubig nga mainom nga gidugangan sa ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), ug neomycin (1.4 mg/mL) (tanan gipalit gikan sa Shanghai, China, mga artipisyal nga organismo) [22] ].].Ang mga ilaga nga nawad-an sa abilidad sa pagkaon ug pag-inom sulod sa> 24 ka oras ug nawad-an og ≥ 20% nga gibug-aton sa lawas kay tawhanon nga gi-euthanize pinaagi sa cervical dislocation.
Ang WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) gidugangan og 12.5% ​​fetal bovine serum (FBS; Every Green, Zhejiang, China) ug 0.1% bovine bile (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).USA) ubos sa microaerobic nga kondisyon.Ang mga confluent trophozoites gikolekta sa yelo ug gipasa sa ratio nga 1: 4 alang sa dugang nga pagpanganak.
Giardia duodenum cysts naaghat sama sa gihulagway kaniadto [23], trophozoites ani sa logarithmic phase ug unya lasaw uban sa encapsulation inducing medium, pH 7.1 (giusab TYI-S-33) ngadto sa usa ka katapusan nga konsentrasyon sa 1 × 106 trophozoites / mL.konsentrasyon sa bile 0.05% medium).Ang mga trophozoites gikulata ubos sa anaerobic nga kondisyon sa 37 ° C hangtud sa logarithmic growth phase.Usba ang medium ngadto sa cyst inducing medium (pH 7.8; giusab nga TYI-S-33 medium nga adunay 1% nga konsentrasyon sa bile) ug kultura G. duodenalis sa 37 ° C sulod sa 48-96 ka oras, diin ang formation cysts naobserbahan ubos sa mikroskopyo.Human ang kadaghanan sa mga trophozoites naaghat sa pagporma og mga cyst, ang sagol nga kultura giani ug gisuspinde pag-usab sa sterile nga deionized nga tubig aron lyse ang nahabilin nga trophozoites.Ang mga cyst giihap ug gitipigan sa 4 ° C alang sa sunod nga pag-analisar pinaagi sa gastric tube sa mga ilaga.
Giardia extracellular vesicle (GEVs) gipadato sama sa gihulagway kaniadto [13].Ang mga trophozoites sa logarithmic growth phase gisuspinde sa giusab nga TYI-S-33 medium nga giandam uban sa exosome-depleted FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) ngadto sa katapusang konsentrasyon sa 1 × 106 parasites / mL ug gilumlum sulod sa 12 ka oras.gilain gikan sa supernatant sa kultura pinaagi sa centrifugation sa 2000 g sa 10 min, 10,000 g sa 45 min, ug 100,000 g sa 60 min.Ang mga precipitates natunaw sa phosphate buffered saline (PBS), gi-quantified gamit ang BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ug gitipigan sa -80 ° C. o gigamit direkta alang sa dugang nga pag-analisar.
Ang panguna nga mouse peritoneal macrophage giandam sama sa gihulagway kaniadto [24].Sa laktod, ang mga ilaga (nag-edad 6-8 ka semana) gi-injected (intraperitoneally [ip]) nga adunay 2.5 ml nga 2.98% Difco liquid thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) ug gipakaon ang 3-4 palates.Usa ka suspension sa macrophage nakolekta gikan sa tiyan lungag sa mga ilaga human sa euthanasia ug centrifuged 3 nga mga panahon sa 1000 g alang sa 10 min.Ang mga na-ani nga mga selyula nakit-an pinaagi sa flow cytometry gamit ang CD11b marker hangtod nga ang kaputli sa cell mao ang> 98%, unya gidugang sa 6-well cell culture plates (4.5 x 106 cells / well) ug gilumlum sa 10% FBS (Bioindustriya) sa 37 ° C.ug 5% CO2.
Ang RNA gikuha gikan sa 1 × 107 trophozoites sa 1 ml sa TRIzol reagent (Vazyme, Nanjing, China), ang genomic DNA gikuha gikan sa kinatibuk-ang G. duodenalis RNA gamit ang MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) ug ang complementary DNA (cDNA) gi-synthesize. gamit ang MonScript RTIIII Super Mix (Monad) sumala sa instruksyon sa tiggama.
Ang kasayuran sa han-ay sa CDS alang sa target nga G. duodenalis gene nakuha gikan sa NCBI GenBank.Gamita ang Primer 5.0 sa pagdesinyo sa piho nga seamless cloning primers alang sa matag target nga gene.Ang unahan nga primer (5′-3′) naglangkob sa tulo ka bahin: usa ka nagsapaw-sapaw nga han-ay sa usa ka linearized vector pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTTCTGCAGAT) ug magsugod codon ATG ug GNN (kon ang unang base dili G).Gihimo kini aron mapauswag ang kahusayan sa ekspresyon.Dugang pa, labing menos 16 bp hiniusa nga base (GC content 40–60%/Tm gibanabana nga 55 °C).Ang reverse primer (5′-3′) naglangkob sa duha ka bahin, usa ka nagsapaw-sapaw nga han-ay sa usa ka EcoRV-linearized vector pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) ug usa ka hiniusa nga base sa labing menos 16 bp.(walay labot ang kataposang duha ka paghunong).base) usa ka codon sama sa AA o GA aron tugutan ang mga recombinant nga plasmid nga ipahayag ang ilang gimarkahan nga mga protina).Ang mga primer sequence gilista sa Table 1 ug gi-synthesize sa Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, China).
Ang mga target gipadako gamit ang Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, China) o Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) gamit ang giandam nga G. duodenalis cDNA isip template.Ang eukaryotic expression vector plasmid pcDNA3.1(+) gi-linearized sa restriction enzyme EcoRV ug dephosphorylated gamit ang Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Ang linearized pcDNA3.1(+) nga mga tipik ug gipadako nga target nga mga tipik sa gene giputli gamit ang DNA gel purification kit (Tiangen) ug gi-quantified gamit ang Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Ang pcDNA3.1(+) fragment ug ang matag target gene fragment gi-recombined gamit ang MonClone single assembly cloning mix (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) ug gikumpirma sa DNA sequencing gamit ang Comate Bioscience Company Limited (Changchun, China)..
Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ug pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 namugna gamit ang SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Ang konsentrasyon gimentinar labaw sa 500 ng/µl aron maseguro nga ang EDTA sa elution buffer dili makabalda sa transfection assay.Ang panguna nga mouse peritoneal macrophage gikulata sa 6-well plates nga adunay kompleto nga RPMI 1640 medium (Biological Industries) sulod sa 12 ka oras, dayon ang mga selula gihugasan 3 ka beses sa mainit nga PBS aron makuha ang penicillin ug streptomycin, ug dayon sa medium nga gidugangan sa kompleto nga medium.Endotoxin-free plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ug pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ang lasaw sa 125 μl sa Opti-MEM nga pagkunhod sa serum medium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Unya 5 µl sa Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) lasaw sa 125 µl sa ubos nga serum Opti-MEM medium.Pag-andam sa liposome-DNA complexes pinaagi sa pagsagol sa lasaw nga endotoxin-free plasmid sa Lipofectamine 2000 ug tugotan ang sagol nga mobarog sa temperatura sa lawak sulod sa 5 minutos.Ibalhin ang mga complex nga gilain sa mga cell sa matag atabay ug hinayhinay nga isagol.Human sa 4 ka oras, ang cell culture medium gipulihan sa 2 ml nga kompleto nga RPMI 1640 medium ug ang kultura nagpadayon sulod sa 24 ka oras.Ang lab-as nga cell culture medium gidugang sa mga cell ug gilumlom sa lainlaing mga punto sa oras depende sa disenyo sa assay.
Ang mga sample sa protina gikan sa mga supernatant ug cell lysates giandam sama sa gihulagway kaniadto [25].Ang mga parameter sa pagbalhin sa lamad alang sa pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, ug His-tag mao ang 200 mA / 90 min.Para sa interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Switzerland) ug NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Switzerland) ug 1:5000 nga nagpunting sa Iyang tag (Amylet Scientific, Wuhan, China) ug β-actin (Proteintech, Wuhan, China).
Ang cross-linking sa disuccinimide suberate (DSS) gihimo sama sa gihulagway kaniadto [26].Ang mga selyula gihugasan 3 ka beses sa bugnaw nga PBS ug hingpit nga gi-lysed sa usa ka 27 gauge needle sa 50 μl ASC reaction buffer (pH 8.0) nga adunay 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES ug 125 mM NaHCO3.Ang sagol nga centrifuged sa 5000 g alang sa 3 min ug ang pellet gitahi sa 10 μl DSS (25 mM sa DMSO) ug 40 μl ASC reaksyon buffer alang sa 30 min sa 37 ° C.Human sa centrifugation sa 5000 g sa 10 min, ang pellet natunaw sa usa ka solusyon nga 40 µl sa ASC reaction buffer ug 10 µl sa 6x protein loading buffer (TransGen, Beijing, China), ug dayon ang solusyon gipalong sa temperatura sa lawak sulod sa 15 ka oras. min., Unya pabukala 10 minutos.Ang mga sample sa protina dayon gipailalom sa Western blotting gamit ang panguna nga anti-ASC antibodies (Wanleibio, Shenyang, China) sa usa ka dilution ratio nga 1:500.
Pagkahuman sa usa ka kaniadto nga gihulagway nga pamaagi [13], ang mga supernatant sa cell culture giani ug ang pagtago sa pro-inflammatory cytokine IL-1β gitino gamit ang mouse IL-1 Beta ELISA kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).I-convert ang mga kantidad sa OD450nm sa mga konsentrasyon sa protina gamit ang IL-1β standard curve.
Ang mga selula nga gitabonan sa mga coverslip hinay nga gihugasan 3 ka beses sa mainit nga PBS, gitakda sa tissue cell fixative (Biosharp, Beijing, China) sulod sa 10 min sa temperatura sa lawak (RT), sa 0.1% Triton X-Permeabilize sa 100 (natunaw sa PBS; Biosharp ) sulod sa 20 minutos sa temperatura sa lawak ug i-block sa 5% bovine serum albumin (sa PBS) sulod sa 2 ka oras sa temperatura sa lawak.Ang mga selula dayon gilumlom sa tibuok gabii sa 4 ° C nga adunay nag-unang antibodies batok sa ASC (1: 100 dilution) o NLRP3 (1: 100 dilution), matag usa, ug Cy3 nga gimarkahan nga kanding nga anti-rabbit IgG (H + L) (1: 400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) o FITC-conjugated goat anti-mouse IgG (1:400; Earthox) sa tibuok gabii sa 37°C sa kangitngit sulod sa 1 ka oras.Ang nuclei namansahan sa Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, China) sulod sa 5 minutos ug giobserbahan ubos sa fluorescence microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Ang mga ilaga gibahin ngadto sa upat ka grupo (n = 7 sa matag grupo): (i) PBS-treated negative control group (PBS lang; gavage 100 µl/mouse PBS nga gisundan sa adlaw-adlaw nga intraperitoneal injection 100 µl/mouse PBS 3 ka oras ang milabay) ., padayon sulod sa 7 ka adlaw);(ii) negatibo nga kontrol nga grupo nga gitambalan sa MCC950 inhibitor [27] (100 µl/mouse pinaagi sa PBS gavage, 3 ka oras sa ulahi, 10 mg/kg body weight [BW] MCC950 [sa PBS] gipangalagad intraperitoneally kada adlaw, gidugayon sa 7 ka adlaw);(iii) G. duodenalis cyst infection group (1.5 x 106 cysts/mouse by gavage, 3 hours later, 100 μl/mouse PBS intraperitoneally ipangalagad kada adlaw sulod sa 7 ka adlaw);(iv) G. duodenalis cyst hiniusa nga grupo sa impeksyon nga MCC950 inhibitor nga grupo sa pagtambal (1.5 × 106 cysts/mouse pinaagi sa gavage, 10mg/kg body weight MCC950 intraperitoneally kada adlaw sulod sa 7 ka adlaw sa 3h).Ang gibug-aton sa lawas sa matag ilaga gimonitor kada adlaw ug ang tanang mga ilaga gi-euthanize sa ika-7 nga adlaw.Ang naani nga duodenum (3 cm ang gitas-on) giputol sa gagmay nga mga piraso sa 1 ml PBS, ang mga cyst gilaglag sa tibuok gabii sa PBS sa 4 ° C, ug G. duodenalis trophozoites.Ang lab-as nga duodenum (1 cm ang gitas-on) gilain alang sa hematoxylin ug eosin (H&E) nga pagmantsa.
Ang mga ilaga gibahin sa duha ka grupo: (i) MOCK control group ug (ii) MCC950 inhibitor group.Adunay lima ka mga pagtambal sa matag grupo (n = 7 / grupo sa pagtambal): (i) PBS nga pagtambal negatibo nga kontrol nga grupo (PBS lamang; 100 µl / mouse PBS, intramuscular (IM) injection (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plasmid negative control group (100 µg/mouse DNA, pinaagi sa intramuscular injection); grupo nga gitambalan sa plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/mouse DNA, pinaagi sa intramuscular injection), ug (v) usa ka grupo nga gitambalan sa plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 μg/mouse Ang DNA, human sa 12 ka oras nga pagpasa, ang mga ilaga sa MCC950 inhibitor nga grupo nakadawat sa usa ka adlaw-adlaw nga intraperitoneal injection sa MCC950 (10 mg / kg nga timbang sa lawas) sulod sa 7 ka adlaw, samtang ang mga ilaga sa MOCK nga grupo nakadawat og patas nga gidaghanon sa PBS nga pagtambal. nga nakolekta gikan sa eyeballs nga mga ilaga ug gibiyaan sa tibuok gabii sa 4 °C Serum nga mga sample gilain gamit ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) alang sa ug mga pagsukod sa IL-1β nga lebel.
Katloan ug lima ka mga ilaga gibahin ngadto sa lima ka grupo (n=7/grupo).Ang Grupo 1 usa ka negatibo nga grupo sa pagkontrol nga gitambalan sa PBS: ang mga ilaga nakadawat 100 μl sa PBS intramuscularly ug 3 ka adlaw sa ulahi pinaagi sa gavage.Ang Group 2 usa ka positibo nga grupo sa pagkontrol nga nataptan sa G. duodenalis cysts: ang mga ilaga gi-injected sa 100 μl sa PBS, ug 3 ka adlaw sa ulahi 1.5 x 106 cysts / mouse gi-injected intragastrially.Ikatulo nga grupo - plasmid immunization nga adunay pcDNA3.1 (+) inubanan sa usa ka control group alang sa impeksyon sa duodenal cyst: ang mga ilaga nakadawat 100 μg sa plasmid DNA pcDNA3.1 (+) (im) nga binaba, 1.5 × 106 cysts / mouse 3 alang sa daghang mga adlaw.Ang mga grupo 4 ug 5 mao ang recombinant pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid sa kombinasyon sa G. duodenalis cyst infection.Eksperimental nga grupo: ang mga ilaga nakadawat og 100 µg sa pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), unya 3 ka adlaw sa ulahi, 1.5 × 106 cysts/mouse gi-injected pinaagi sa gavage.Ang gibug-aton sa lawas sa matag mouse gibantayan human sa pagpaila sa G. duodenalis cyst pinaagi sa tubo.Ang lab-as nga duodenum gikolekta alang sa parasitic load measurements ug HE staining analysis.
Ang mga pagbag-o sa histopathological gisusi sumala sa usa ka gimantala nga pamaagi kaniadto [30].Ang lab-as nga duodenum giayo sa tissue cell fixative, gisulod sa paraffin, giputol sa 4 μm nga mga seksyon, gimantsa sa H&E ug gisusi ubos sa light microscope.Ang mga representante sa pathological nga mga pagbag-o sa pito ka mga seksyon sa tisyu gikan sa pito ka independente nga mga ilaga gisusi sa usa ka pathologist nga wala nahibal-an sa pagtambal ug nakuha sa 200x nga pagpadako.Ang gitas-on sa villi ug ang giladmon sa mga crypts gisukod sumala sa gihulagway kaniadto nga mga pamaagi.
Ang mga resulta sa vitro ug in vivo nakuha sa triplicate.Ang mga graph gihimo gamit ang GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Ang mga kalainan tali sa duha ka grupo gisusi pinaagi sa t-test, samtang ang mga kalainan tali sa ≥3 nga mga grupo gisusi pinaagi sa one-way analysis of variance (ANOVA) gamit ang SPSS software (bersyon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Gisusi ang mga datos alang sa homogeneity of variance gamit ang Levene's test nga gisundan sa post hoc test ni Bonferroni (B).Ang kahulogan gipahayag nga P<0.05, P<0.01, ug P<0.001 (dili mahinungdanon [ns]) (P>0.05).
Ang among miaging pag-analisa sa GEV proteomics sa Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) nagpakita nga daghang mga target ang mahimong maapil sa pagpaaktibo sa mga agianan sa pagsenyas sa panghubag [13].Gipili namo ang duha ka promising target, alpha-2 ug alpha-7.3 giardins, padaghanon kini nga mga molekula ug gamiton kini sa paghimo sa pcDNA3.1(+) eukaryotic expression vector.Human sa sequencing, recombinant pcDNA3.1 (+) -alpha-2 ug alpha-7.3 giardine expression plasmids gibalhin ngadto sa nag-unang mouse peritoneal macrophage, ug ang caspase-1 p20 signature protina sa panghubag (usa ka tipik sa activated caspase-1) giila. ingon nga nagpatin-aw sa yawe nga mga molekula nga mahimong hinungdan sa panghubag.Gipakita sa mga resulta nga ang alpha-2 ug alpha-7.3 giardines makahimo sa p20 caspase-1 nga ekspresyon nga susama sa GEV.Walay epekto sa caspase-1 nga pagpaaktibo ang nakit-an sa wala matambalan nga negatibo nga kontrol (PBS lamang) ug plasmid control pcDNA3.1 (+) (Figure 1).
Pagsukod sa p20 caspase-1 nga pagpaaktibo sa pcDNA3.1 (+) -alpha-2 ug alpha-7.3 giardins.Ang recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 ug alpha-7.3 giardines (ibabaw sa matag lane) gibalhin ngadto sa nag-unang mouse peritoneal macrophage ug ang mga supernatant sa kultura giani 24 ka oras sa ulahi.Ang Western blotting gigamit sa pagsukod sa lebel sa ekspresyon sa signature caspase-1 p20 inflammasome protein.Ang PBS-only treatment group (lane C) ug ang pcDNA3.1(+) monotherapy group (pcDNA3.1 lane) gigamit isip negatibo nga kontrol, ug ang GEV treatment group gigamit isip positibo nga kontrol.Ang pagpahayag sa recombinant nga protina gipamatud-an pinaagi sa pag-ila sa usa ka histidine tag sa matag protina, ug ang gipaabot nga protina bands mao ang alpha-2 giardine (38.2 kDa) ug alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, Giardia duodenum extracellular vesicle, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearized vector, SUP, supernatant
Aron mahibal-an kung ang alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine nag-aghat sa p20 caspase-1 nga ekspresyon ug adunay papel sa pagpaaktibo sa host NLRP3 nga makapahubag nga tubag, pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine ug pcDNA3.1 (+) -alpha -7.3 giardin gibalhin ngadto sa nag-unang mouse peritoneal macrophage uban sa recombinant plasmid DNA, ug ang lebel sa ekspresyon, localization, ug oligomerization sa mga yawe nga makapahubag protina NLRP3 determinado.Niini nga eksperimento, ang GEV gigamit isip positibo nga kontrol nga grupo, ug ang walay pagtambal nga grupo (PBS lamang) o ang pcDNA3.1 (+) transfection nga grupo sa pagtambal mao ang negatibo nga grupo.Ang mga resulta nagpakita nga, sama sa GEV nga grupo, ang recombinant plasmid DNA sa giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 ug giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 miresulta sa upregulation sa NLRP3, pro-IL-1β ug procaspase-1 ug caspase-1 activation (Fig. 2a).Dugang pa, ang duha ka giardine nagpahinabog mahinungdanong IL-1β nga pagtago (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P<0.0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figure 2b).Kadaghanan sa mga protina sa ASC mga monomeric sa grupo nga wala’y pagtambal o sa grupo sa pagtambal nga gibalhin sa pcDNA3.1 (+) plasmid, sukwahi sa pcDNA3.1 (+) -alpha-2 o pcDNA3.1 (+) -alpha- 7.3 giardine.Ang ASC oligomerization nahitabo sa recombinant plasmid DNA sa GEV positive control group o grupo, nga nagpakita sa usa ka oligomeric nga porma (Figure 2c).Kini nga mga pasiuna nga datos nagsugyot nga ang alpha-2 giardine ug alpha-7,3 giardine mahimong hinungdan sa pagpaaktibo sa panghubag sa NLRP3.Ang sunod nga immunofluorescent nga mga pagtuon sa localization sa ASC ug NLRP3 nagpakita nga sa negatibo nga kontrol nga grupo, ang ASC nga protina nagkatibulaag sa tibuok cytoplasm ug nagpakita ingon nga usa ka tuldok nga signal sa pagpukaw sa pcDNA3.1 (+) -alpha-2 nga adunay giardine o pcDNA3.1 (+) -alpha-7,3 giardine nga grupo o GEV positibo nga kontrol nga grupo (Figure 2d).Sa negatibo nga kontrol ug plasmid-treated nga pcDNA 3.1 nga mga grupo, ang NLRP3 protein signal wala mamatikdan, samtang ang usa ka fluorescent signal dot agig tubag sa pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 nakit-an..Ang giardine makita sa cytoplasm o sa stimulation sa HEV (Fig. 2e).Kini nga mga datos dugang nagpakita nga ang G. duodenalis giardin alpha-2 ug giardin alpha-7.3 nagpalihok sa NLRP3 inflammasome sa mouse primary peritoneal macrophage.
Ang pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ug pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin nagpalihok sa NLRP3 inflammasome sa mouse peritoneal macrophage.Ibalhin ang recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin ug pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin ngadto sa primary murine peritoneal macrophage ug mga selula, o anihon ang supernatant sulod sa 24 h para sa pagtuki sa ekspresyon, oligomerization , sekreto.ug localization sa yawe nga makapahubag protina.Ang PBS-only (C) nga grupo ug ang pcDNA3.1 (+) single treatment group gigamit isip negatibo nga kontrol, ug ang GEV treatment group gigamit isip positibo nga grupo.usa ka Key inflammatory proteins NLRP3, lakip na ang NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, ug p20 caspase-1, nakit-an sa Western blotting.b Ang lebel sa pagtago sa IL-1β sa mga supernatant gitino gamit ang enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Ang mga kalainan tali sa kontrol ug eksperimento nga mga grupo gisusi pinaagi sa one-way analysis of variance (ANOVA) gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong kalainan tali sa mga grupo ** P <0.01 ug *** P <0.001.c ASC oligomerization nga lebel sa mga pellets gitino pinaagi sa DSS cross-linking analysis, samtang ang ASC level sa cell lysates gigamit isip loading control.d Visualization sa ISC localization gamit ang immunofluorescence.e Immunofluorescence gigamit sa paghanduraw sa localization sa NLRP3.ASC, apoptotic speck-sama sa protina;IL, interleukin;NLRP3, nucleotide-binding oligomerization-like receptor 3;ns, dili mahinungdanon (P > 0.05)
Ang G. duodenalis ug ang GEVs nga gitago niini nagpalihok sa NLRP3 inflammasome ug nag-regulate sa host inflammatory responses in vitro.Busa, ang papel sa NLRP3 inflammasome sa pathogenicity sa G. duodenalis nagpabilin nga dili klaro.Aron imbestigahan kini nga isyu, nagdesinyo kami og eksperimento tali sa mga ilaga nga nataptan sa G. duodenalis cyst ug mga ilaga nga nataptan sa G. duodenalis cyst + MCC950 inhibitor nga pagtambal ug gitandi ang NLRP3 inflammasome nga ekspresyon sa dihang nataptan sa G. duodenalis cyst.Ang usa ka detalyado nga laraw sa eksperimento gipakita sa Fig. 3a.Ang mga pagbag-o sa gibug-aton sa lawas sa mga ilaga sa lainlaing mga grupo sa pagtambal gibantayan sa 7 ka adlaw pagkahuman sa impeksyon sa mga cyst, ug ang mga resulta gipakita sa Fig. 3b.Kung itandi sa grupo nga gitambalan sa lunsay nga PBS, ang mga resulta nagpakita nga (i) ang gibug-aton sa lawas sa mga ilaga nga nataptan sa G. duodenalis cyst mikunhod gikan sa adlaw nga 3 ngadto sa adlaw nga 7 human sa impeksyon;(ii) ang pagtambal sa MCC950 inhibitor walay mahinungdanong epekto sa gibug-aton sa lawas sa mga ilaga..Kung itandi sa usa ka grupo sa impeksyon, ang BW sa grupo sa impeksyon sa duodenal nga gitambalan sa MCC950 mikunhod sa lainlaing degree (Day 1: ANOVA, F (3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Day 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001; Adlaw 3: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Adlaw 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175;Kini nga mga datos nagpakita nga ang NLRP3 inflammasome nanalipod sa mga ilaga gikan sa mahinungdanon nga pagkawala sa timbang sa unang mga hugna (2-4 ka adlaw) sa duodenal infection.Gipunting dayon namo ang pag-ila sa G. duodenalis trophozoites sa duodenal lavage fluid ug ang mga resulta gipakita sa Figure 3c.Kung itandi sa G. duodenalis cyst infection nga grupo, ang gidaghanon sa mga trophozoites sa duodenum miuswag pag-ayo human sa pagbabag sa NLRP3 inflammasome (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Ang mga tisyu sa duodenal nga namansahan sa HE nagpakita, kon itandi sa negatibong kontrol nga gitambalan sa PBS ug MCC950 lamang: ​​(i) G. duodenalis cyst infection miresulta sa kadaot sa duodenal villi (ANOVA, F(3, 24)=0.4903, P= 0.0488 ) ug crypt atrophy (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duodenum gikan sa mga ilaga nga nataptan sa G. duodenalis cysts ug gitambalan sa MCC950 inhibitors.ang duodenal villi nadaot ug namatay (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) nga adunay atrophy ug crypt branching (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f).Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang NLRP3 inflammasome adunay papel sa pagpakunhod sa pathogenicity sa G. duodenalis.
Papel sa NLRP3 inflammasome sa Giardia duodenum infection.Ang mga ilaga gigavaged (iv) nga adunay mga duodenococcal cyst ug dayon gitambalan nga adunay o wala ang MCC950 (ip).Ang mga single treatment group nga adunay PBS o MCC950 gigamit isip mga kontrol.Eksperimental nga grupo ug regimen sa pagtambal.b Ang gibug-aton sa lawas sa mga ilaga sa matag usa sa nagkalain-laing mga grupo sa pagtambal gimonitor sulod sa 7 ka adlaw.Ang kalainan tali sa G. duodenalis infection group ug sa G. duodenalis + MCC950 infection treatment group gisusi pinaagi sa t-test gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa * P <0.05, ** P <0.01, o *** P <0.001.c Parasitic load gitino pinaagi sa pag-ihap sa gidaghanon sa mga trophozoites sa duodenal lavage fluid.Ang kalainan tali sa G. duodenalis infection group ug sa G. duodenalis + MCC950 infection treatment group gisusi pinaagi sa t-test gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa * P <0.05.d Hematoxylin ug eosin (H&E) pagmantsa resulta sa duodenal histopathology.Ang pula nga mga pana nagpakita sa kadaot sa villi, ang berde nga mga pana nagpakita sa kadaot sa mga crypts.Scale bar: 100 µm.e, f Statistical analysis sa duodenal villus height ug mouse crypt height.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa * P <0.05 ug ** P <0.01.Ang mga resulta gikuha gikan sa 7 ka independente nga biolohikal nga mga eksperimento.BW, gibug-aton sa lawas;ig, ruta sa paghatud sa intragastric;ip, intraperitoneal nga ruta sa paghatod;ns, dili mahinungdanon (P > 0.05);PBS, phosphate buffered saline;WT, wild type
Ang pagtago sa IL-1β usa ka timaan sa pagpaaktibo sa panghubag.Aron mahibal-an kung ang G. duodenalis alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine nagpalihok sa NLRP3 host inflammasome sa vivo, gigamit namo ang wala matambalan nga WT nga mga ilaga (sham group) ug NLRP3 inflammasome-blocked nga mga ilaga (MCC950 inhibited treatment group).Ang usa ka detalyado nga laraw sa eksperimento gipakita sa Fig. 4a.Ang mga eksperimento nga grupo naglangkob sa mga ilaga nga gitambalan sa PBS, G. duodenalis cyst nga pagtambal pinaagi sa gavage, intramuscular injection sa pcDNA3.1, ug intramuscular injection sa pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine o pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Sa ika-7 nga adlaw pagkahuman sa intramuscular administration sa recombinant plasmid, ang serum nakolekta ug ang lebel sa IL-1β sa matag grupo gitino.Sama sa gipakita sa Figure 4b, sa MOCK nga grupo: (i) kon itandi sa PBS nga grupo, ang pcDNA3.1 nga pagtambal walay mahinungdanong epekto sa IL-1β secretion (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), bisan pa, Ang pagtago sa IL-β mahinungdanon nga gipataas sa G. duodenalis cyst group (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine ug pcDNA3.1- Intramuscular injection sa alpha-7.3 giardine kamahinungdanon misaka sa serum IL-1β nga lebel (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine nga hinungdan sa taas nga lebel sa IL -1β nga pagtago sa pcDNA3.1-alpha-2 giardine intramuscular injection group (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Kung itandi sa matag grupo sa MCC950 nga grupo sa pagtambal ug sa MOCK nga grupo: (i) IL-1β nga lebel sa pagtago sa PBS control group ug ang pcDNA3.1 control group mikunhod ngadto sa usa ka sukod human sa pagbabag sa MCC950 inhibitor, apan ang kalainan dili. mahinungdanon (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) human gibabagan ang MCC950., Ang pagtago sa IL-1β dako kaayo nga pagkunhod sa G. duodenalis cyst-infected nga grupo, ang pcDNA3.1-alpha-2 giardine nga grupo, ug ang pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine nga grupo (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3.540 , P = 0.0120; pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.0447; ) = 3.540, P = 0.0164).Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine nagpataliwala sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa vivo.
Ang pcDNA3.1(+)-giardines nagpalihok sa NLRP3 host inflammasome sa vivo.Ang mga ilaga nabakunahan (IM) nga adunay recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ug dayon gitambalan sa MCC950 (ip; MCC950 group) o dili (dummy group) ).Ang PBS o pcDNA3.1 (+) plasmid treatment group gigamit isip negatibo nga kontrol, ang G. duodenalis cyst treatment group gigamit isip positibo nga kontrol.Eksperimental nga grupo ug regimen sa pagtambal.b Ang lebel sa serum sa IL-1β sa mga ilaga gisukod sa adlaw nga 7 pinaagi sa ELISA assay.Ang mga kalainan tali sa mga grupo sa MOCK nga grupo gisusi gamit ang one-way ANOVA, ug ang mga kalainan tali sa MOCK nga grupo ug sa MCC950 nga grupo gisusi gamit ang t-test sa SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong kalainan tali sa mga grupo sa pagtambal sa MOCK nga grupo, * P <0.05 ug *** P <0.001;dolyar nga mga timailhan ($) nagpakita sa mahinungdanon nga mga kalainan tali sa matag grupo sa MOCK nga grupo ug sa MCC950 nga grupo sa P<0.05.Resulta sa pito ka independente nga biolohikal nga mga eksperimento.i, intramuscular injection, ns, dili mahinungdanon (P> 0.05)
Aron masusi ang epekto sa alpha-2 ug alpha-7.3 giardine-mediated activation sa NLRP3 host inflammasome sa G. duodenalis infectivity, gigamit namo ang WT C57BL / 6 nga mga ilaga ug gi-injected ang alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine.ang plasmid gi-injected intramuscularly, human sa 3 ka adlaw pinaagi sa gastric tube sa G. duodenalis cyst, human niini ang mga ilaga naobserbahan sulod sa 7 ka adlaw.Ang usa ka detalyado nga laraw sa eksperimento gipakita sa Fig. 5a.Ang gibug-aton sa lawas sa matag mouse gisukod matag adlaw, ang mga sample sa presko nga duodenal tissue nakolekta sa ika-7 nga adlaw human sa administrasyon pinaagi sa gastric tube, ang gidaghanon sa mga trophozoites gisukod, ug ang mga pagbag-o sa histopathological naobserbahan.Sama sa gipakita sa Figure 5b, uban sa pagdugang sa oras sa pagpakaon, ang BW sa mga ilaga sa matag grupo hinay-hinay nga misaka.Ang MT sa mga ilaga nagsugod sa pagkunhod sa ika-3 nga adlaw human sa intragastric nga administrasyon sa G. duodenalis cysts, ug unya anam-anam nga misaka.Ang pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome nga gipahinabo sa intramuscular injection sa alpha-2 giardine ug alpha7.3 giardine kamahinungdanon nga pagkunhod sa gibug-aton sa mga ilaga (Day 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Adlaw 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Adlaw 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Adlaw 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Adlaw 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.8222, P = 0.0083; Adlaw 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine , F(4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Day 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5620, P <0.0001, Day 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Day 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P <0.0001 Day 6: pcDNA3 . alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Day 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Adlaw 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Adlaw 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).Ang parasitic load gisusi sa duodenum (Fig. 5c).Kung itandi sa wala matambalan nga positibo nga kontrol ug ang grupo nga gi-injected sa walay sulod nga pcDNA3.1 vector, ang gidaghanon sa G. duodenalis trophozoites mikunhod pag-ayo sa mga grupo nga gi-injected sa α-2 giardine ug α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha). -2 giardine : ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.209, P<0.0001).Dugang pa, ang giardine alfa-7.3 mas mapanalipdan sa mga ilaga kay sa giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Ang mga resulta sa HE staining gipakita sa fig.5d–f.Ang mga ilaga nga gi-injected sa alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine adunay mas gamay nga duodenal tissue lesions, nga gipakita sa villus damage, kon itandi sa mga ilaga nga gi-injected sa G. duodenalis ug mga ilaga nga gi-injected sa G. duodenalis sa kombinasyon sa usa ka walay sulod nga pcDNA3 vector .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 o P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0028 o P = 0.0055) ug pagkunhod sa crypt atrophy (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.470, P = 0.0264 o P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine , F(3, 24) = 1.470, P = 0.0371 o P = 0.0191).Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang alpha-2 giardine ug alpha-7,3 giardine makapakunhod sa pagka-infectivity sa G. duodenalis pinaagi sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa vivo.
Papel sa pcDNA3.1 (+) -giardins sa impeksyon sa G. duodenalis.Ang mga ilaga gibakunahan (IM) sa recombinant eukaryotic expression plasmids pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine o pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ug dayon gihagit sa G. duodenalis cysts (ig).Ang grupo sa PBS ug ang pcDNA3.1(+) + duodenal cyst treatment group gigamit isip negatibong control group, ug ang duodenal cyst treatment group gigamit isip positive control group.Eksperimental nga grupo ug regimen sa pagtambal.b Ang MT sa mga ilaga sa matag usa sa lainlaing mga grupo sa pagtambal gibantayan alang sa 7 nga mga adlaw nga post-challenge.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan tali sa mga grupo sa G. duodenalis nga grupo ug sa pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine nga grupo, * P <0.05, ** P <0.01, ug *** P <0.001;ang dolyar nga ilhanan ($) nagpakita sa usa ka mahinungdanon nga kalainan tali sa matag grupo sa G. duodenalis ug sa pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine nga grupo, $$P<0.01 ug $$$P<0.001.c Parasitic load gitino pinaagi sa pag-ihap sa gidaghanon sa mga trophozoites sa 1 ml sa duodenal lavage gikan sa duodenum (3 cm ang gitas-on) ug gipahayag ingon nga ang gidaghanon sa mga parasito kada cm sa duodenum.Ang mga kalainan tali sa grupo sa impeksyon sa G. duodenalis, ang pcDNA3.1 (+) -alpha-2 giardine nga grupo, ug ang pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 giardine nga grupo gisusi sa one-way ANOVA gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa ** P <0.01 ug *** P <0.001.d Mga pagbag-o sa histopathological sa duodenum.Ang pula nga mga pana nagpakita sa kadaot sa villi, ang berde nga mga pana nagpakita sa kadaot sa mga crypts.Scale bar: 100 µm.e, f Statistical analysis sa mouse duodenal villus height (e) ug crypt height (f).Ang mga kalainan tali sa mga grupo sa Figure 1d gisusi sa one-way ANOVA gamit ang SPSS software version 22.0.Ang mga asterisk nagpakita sa mahinungdanong mga kalainan sa * P <0.05 ug ** P <0.01.Resulta sa pito ka independente nga biolohikal nga mga eksperimento.ns, dili mahinungdanon (P > 0.05)
Ang Giardia duodenum usa ka ilado nga intestinal parasite sa mga tawo ug ubang mga mammal nga maoy hinungdan sa giardiasis.Niadtong 2004, gilakip kini sa WHO Neglected Diseases Initiative tungod sa taas nga pagkaylap niini sulod sa 6 ka tuig, ilabi na sa mga komunidad nga ubos ang socioeconomic status [32].Ang kinaiyanhon nga immune system adunay hinungdanon nga papel sa pagtubag sa imyunidad sa impeksyon sa G. duodenalis.Ang mga macrophage sa ilaga gikataho nga molamoy ug mopatay sa G. duodenalis pinaagi sa pagpagawas sa mga extracellular traps [33].Gipakita sa among nangaging mga pagtuon nga ang G. duodenalis, usa ka non-invasive extracellular parasite, nagpalihok sa p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, ug NLRP3 inflammatory signaling pathways sa mouse macrophage aron makontrol ang host inflammatory responses, ug ang gipagawas nga GEV mahimong makapauswag niini nga proseso.13], 24].Bisan pa, ang eksaktong mga PAMP nga nalambigit sa NLRP3 inflammasome-regulated nga panghubag sa GEV ug ang papel sa NLRP3 inflammasome sa giardiasis nagpabilin nga gipatin-aw.Aron mahatagan ug katin-awan kining duha ka pangutana, among gihimo kini nga pagtuon.
Ang NLRP3 inflammasome nahimutang sa cytoplasm sa immune cells ug mahimong ma-activate sa nagkalain-laing partikulo sama sa uric acid crystals, toxins, bacteria, virus, ug parasites.Sa mga pagtuon sa bakterya, ang mga hilo giila nga mga yawe nga PAMP nga nagpalihok sa mga sensor sa panghubag, nga nagdala sa panghubag ug pagkamatay sa cell [34].Ang ubang mga structurally diverse nga mga hilo, sama sa hemolysin gikan sa Staphylococcus aureus [35] ug Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) gikan sa enterotoxin (NHE) [37], nagpahinabo sa pagpaaktibo sa NLRP3 nga panghubag.Gipakita sa mga pagtuon sa viral nga ang virulence proteins sama sa SARS-COV-2 envelope (E) protein [38] ug Zika virus NS5 protein [39] mga importanteng PAMP nga giila sa NLRP3 receptor.Sa mga pagtuon sa parasito, daghang mga parasito ang gitaho nga nalangkit sa pagpaaktibo sa host inflammasome, sama sa Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41], ug Leishmania [42].Ang dasok nga granule nga mga protina GRA35, GRA42, ug GRA43, nga nalangkit sa pagkadaot sa Toxoplasma gondii, gikinahanglan alang sa induction sa pyroptosis sa Lewis rat macrophage [43].Dugang pa, ang pipila ka pagtuon sa Leishmania naka-focus sa indibidwal nga mga molekula nga nalangkit sa NLRP3 inflammasome, sama sa parasite membrane lipophosphoglycan [44] o zinc metalloprotease [45].Lakip sa annexin-sama sa alpha-giardin nga pamilya sa mga gene, ang alpha-1 giardin gipakita nga usa ka potensyal nga kandidato sa bakuna nga naghatag proteksyon batok sa G. duodenalis sa usa ka modelo sa mouse [18].Sa among pagtuon, gipili namo ang G. duodenalis virulence nga mga hinungdan nga alpha-2 ug alpha-7,3 giardines, nga talagsaon sa giardia apan medyo dili kaayo gitaho.Kining duha ka target nga mga gene gi-clone sa pcDNA3.1(+) eukaryotic expression system vector para sa pagtuki sa pagpaaktibo sa panghubag.
Sa among modelo sa mouse, ang mga giputol nga mga tipik sa caspase nagsilbing mga timaan sa pagpaaktibo sa panghubag.Sa pagpukaw, ang NLRP3 nakig-uban sa ASC, nagrekrut sa mga procaspases, ug nagpatunghag mga aktibo nga caspases nga nagdugtong sa pro-IL-1β ug pro-IL-18 ngadto sa hamtong nga IL-1β ug IL-18, matag usa -18.Ang makapahubag nga mga caspases (caspases-1, -4, -5 ug -11) usa ka gitipigan nga pamilya sa mga cysteine ​​​​protease nga kritikal alang sa natural nga depensa ug nalambigit sa panghubag ug na-program nga pagkamatay sa cell [46].Ang Caspase-1 gi-activate sa canonical inflammasomes [47], samtang ang caspases-4, -5, ug -11 gibuak sa panahon sa pagporma sa atypical inflammasomes [48].Niini nga pagtuon, gigamit namo ang mouse peritoneal macrophage isip usa ka modelo ug gisusi ang p20 caspase-1 cleaved caspase-1 isip usa ka marker sa host NLRP3 nga pagpaaktibo sa panghubag sa mga pagtuon sa impeksyon sa G. duodenalis.Gipakita sa mga resulta nga daghang mga alpha-giardins ang responsable sa tipikal nga pagpaaktibo sa panghubag, nga nahiuyon sa pagkadiskobre sa hinungdanon nga mga molekula sa virulence nga nalambigit sa bakterya ug mga virus.Bisan pa, ang among pagtuon usa lamang ka preliminary screen ug adunay uban nga mga molekula nga makapa-aktibo sa dili klasikal nga mga inflammasome, tungod kay ang among miaging pagtuon nakit-an ang klasikal ug dili klasikal nga mga inflammasome sa impeksyon sa G. duodenalis [13].Aron mas matino kung ang namugna nga p20 caspase-1 nalangkit sa NLRP3 inflammasome, gibalhin namo ang alpha-2 ug alpha-7.3 giardins ngadto sa mouse peritoneal macrophage aron mahibal-an ang importante nga lebel sa ekspresyon sa protina sa molekula ug ang lebel sa oligomerization sa ASC, nga nagpamatuod nga ang α-giardins nag-activate makapahubag NLRP3.Ang among mga resulta gamay nga lahi gikan sa Manko-Prykhoda et al., kinsa nagtaho nga ang stimulation sa Caco-2 nga mga selula nga adunay G. muris o E. coli EPEC strains lamang makadugang sa fluorescence intensity sa NLRP3, ASC, ug caspase-1, bisan dili kaayo, samtang kung giunsa ang costimulation sa G. muris ug E. coli nagdugang sa lebel sa tulo ka mga protina [49].Kini nga kalainan mahimong tungod sa mga kalainan sa pagpili sa mga espisye sa Giardia, mga linya sa cell, ug panguna nga mga selula.Naghimo usab kami sa vivo assays gamit ang MCC950 sa 5-week-old nga babaye nga WT C57BL / 6 nga mga ilaga, nga mas daling makuha sa G. duodenalis.Ang MCC950 usa ka kusgan ug pinili nga gamay nga molekula nga NLRP3 inhibitor nga nagbabag sa canonical ug non-canonical nga NLRP3 nga pagpaaktibo sa nanomolar nga mga konsentrasyon.Ang MCC950 nagpugong sa pagpaaktibo sa NLRP3 apan dili makaapekto sa pagpaaktibo sa AIM2, NLRC4, ug NLRP1 nga mga agianan sa panghubag o TLR signaling pathways [27].Gibabagan sa MCC950 ang pagpaaktibo sa NLRP3 apan wala makapugong sa pagsugod sa NLRP3, K+ efflux, Ca2+ influx, o ang interaksyon tali sa NLRP3 ug ASC;hinoon, kini nagpugong sa NLRP3 inflammasome activation pinaagi sa pagbabag sa ASC oligomerization [27].Busa, gigamit namo ang MCC950 sa usa ka in vivo nga pagtuon aron mahibal-an ang papel sa NLRP3 inflammasome human sa giardine injection.Ang gi-activate nga caspase-1 p10 nagputol sa mga pro-inflammatory cytokines nga pro-IL-1β ug pro-IL-18 ngadto sa hamtong nga IL-1β ug IL-18 [50].Niini nga pagtuon, ang serum IL-1β nga lebel sa giardine-treated nga mga ilaga nga adunay o walay MCC950 gigamit isip timailhan kung ang NLRP3 inflammasome gi-activate.Sama sa gipaabut, ang pagtambal sa MCC950 labi nga nakunhuran ang lebel sa serum IL-1β.Kini nga mga datos klaro nga nagpakita nga ang G. duodenalis giardin alfa-2 ug giardin alfa-7.3 makahimo sa pagpaaktibo sa NLRP3 mouse inflammasome.
Ang mahinungdanon nga datos nga natipon sa milabay nga dekada nagpakita nga ang IL-17A mao ang master regulator sa immunity batok sa G. muris, nga nag-aghat sa IL-17RA nga pagsenyas, pagprodyus og antimicrobial peptides, ug pag-regulate sa complement activation [51].Bisan pa, ang impeksyon sa Giardia kanunay nga mahitabo sa mga batan-on, ug gikataho nga ang impeksyon sa Giardia sa mga batan-ong ilaga wala mag-aktibo sa tubag sa IL-17A aron magamit ang proteksyon nga epekto niini [52], nga nag-aghat sa mga tigdukiduki sa pagpangita sa uban pang immunomodulatory Giardia.mekanismo sa impeksyon sa helminth.Ang mga tigsulat sa usa ka bag-o nga pagtuon nagtaho nga ang G. muris maka-activate sa NLRP3 inflammasome sa E. coli EPEC, nga nagpasiugda sa produksyon sa mga antimicrobial peptides ug nagpamenos sa kapasidad sa pag-attach niini ug ang gidaghanon sa mga trophozoites sa intestinal tract, sa ingon nagpamenos sa kagrabe sa colon. mga sakit nga gipahinabo sa bacilli [49].Ang NLRP3 inflammasome nalangkit sa pagpalambo sa nagkalain-laing mga sakit.Gipakita sa mga pagtuon nga ang Pseudomonas aeruginosa nagpalihok sa autophagy sa mga macrophage aron malikayan ang pagkamatay sa cell, ug kini nga proseso nagdepende sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome [53].Alang sa N. caninum, ang reactive oxygen species-mediated activation sa NLRP3 inflammasome naglimite sa pagkopya niini sa host, nga naghimo niini nga usa ka potensyal nga therapeutic target [9].Ang Paracoccidioides brasiliensis nakit-an nga nagpukaw sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa mga dendritic cells nga nakuha sa utok sa bukog sa mouse, nga miresulta sa pagpagawas sa makapahubag nga cytokine IL-1β, nga adunay hinungdanon nga papel sa depensa sa host [10].Daghang klase sa Leishmania, lakip ang L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, ug L. infantum chagasi, nagpalihok sa NLRP3 ug ASC-dependent nga caspase-1 sa mga macrophage, ingon man sa impeksyon sa Leishmania.Ang pagkopya sa parasito gipauswag sa mga ilaga nga kulang sa NLRP3/ASC/caspase-1 gene [11].Zamboni et al.Ang impeksyon sa Leishmania gikataho nga nag-aghat sa pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome sa mga macrophage, nga naglimite sa intracellular parasite replication.Sa ingon, ang Leishmania mahimong makapugong sa pagpaaktibo sa NLRP3 ingon usa ka estratehiya sa paglikay.Sa mga pagtuon sa vivo, ang NLRP3 inflammasome nakatampo sa pagwagtang sa Leishmania, apan wala makaapekto sa mga tisyu [54].Sa kasukwahi, sa mga pagtuon sa helminthiasis, ang pagpaaktibo sa NLRP3 inflammasome nagpugong sa pagpanalipod sa imyunidad sa host batok sa gastrointestinal helminthiasis [12].Ang Shigella usa sa mga nag-unang bakterya nga hinungdan sa kalibanga sa tibuuk kalibutan.Kini nga mga bakterya mahimong makaaghat sa produksiyon sa IL-1β pinaagi sa P2X7 receptor-mediated K+ efflux, reactive oxygen species, lysosomal acidification, ug mitochondrial damage.Ang NLRP3 inflammasome negatibo nga nag-regulate sa phagocytosis ug bactericidal nga kalihokan sa macrophage batok sa Shigella [55].Gipakita sa mga pagtuon sa Plasmodium nga ang AIM2, NLRP3 o kulang sa caspase-1 nga mga ilaga nga nataptan sa Plasmodium naghimo og taas nga lebel sa type 1 nga interferon ug mas makasugakod sa impeksyon sa Plasmodium [56].Bisan pa, ang papel sa alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine sa pag-aghat sa pathogenic nga pagpaaktibo sa NLRP3 nga panghubag sa mga ilaga dili klaro.
Niini nga pagtuon, ang pagdili sa NLRP3 inflammasome sa MCC950 nagpamenos sa BW ug nagdugang sa gidaghanon sa mga trophozoites sa intestinal lavage fluid sa mga ilaga, nga miresulta sa mas grabe nga mga kausaban sa pathological sa duodenal tissue.Ang Alpha-2 giardine ug alpha-7.3 giardine nagpalihok sa host mouse nga NLRP3 inflammasome, nagdugang sa gibug-aton sa lawas sa mouse, pagpakunhod sa gidaghanon sa mga trophozoites sa intestinal lavage fluid, ug paghupay sa pathological duodenal lesions.Kini nga mga resulta nagsugyot nga ang G. duodenalis maka-activate sa NLRP3 host inflammasome pinaagi sa alpha-2 giardine ug alpha-7,3 giardine, nga makapakunhod sa pathogenicity sa G. duodenalis sa mga ilaga.
Sa kinatibuk-an, gipakita sa among mga resulta nga ang alpha-2 ug alpha-7.3 giardines nag-aghat sa pagpaaktibo sa NLRP3 host inflammasome ug pagkunhod sa infectivity sa G. duodenalis sa mga ilaga.Busa, kini nga mga molekula nagsaad nga mga target alang sa paglikay sa giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: usa ka kinatibuk-ang ideya.Bag-o lang gipadayag nga si Pat Inflamm alerdyik sa mga droga.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: usa ka pagrepaso sa pharmacotherapy.Eksperto nga Opinyon sa usa ka pharmacist.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, pagsukol sa droga ug pagdiskobre sa bag-ong mga target.Makadaot sa mga target sa tambal nga Disorder.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, ug uban pa NLRP3 inflammasome ug makapahubag nga mga sakit.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ang papel sa inflammasome sa intestinal inflammation ug cancer.Gastroenterology.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Canonical ug atypical NLRP3 inflammasome activation sa kinasang-an sa immune tolerance ug gut inflammation.pre-immune.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, ug uban pa.Ang ROS-mediated NLRP3 inflammasome activation nalangkit agig tubag sa N. caninum infection.Vektor sa parasito.2020;13:449.