Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS.Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang mga vector sa gene alang sa pagtambal sa pulmonary cystic fibrosis kinahanglan nga ipunting sa mga agianan sa hangin, tungod kay ang peripheral lung transduction walay therapeutic effect.Ang kaepektibo sa pagbalhin sa viral direkta nga may kalabutan sa oras sa pagpuyo sa carrier.Bisan pa, ang mga pluwido sa paghatod sama sa mga tagdala sa gene natural nga mokatap sa alveoli sa panahon sa pagginhawa, ug ang mga partikulo sa terapyutik sa bisan unsang porma dali nga makuha pinaagi sa mucociliary transport.Ang pagpalawig sa oras sa pagpuyo sa mga tagdala sa gene sa respiratory tract importante apan lisud makab-ot.Ang carrier-conjugated magnetic nga mga partikulo nga mahimong idirekta sa ibabaw sa respiratory tract makapauswag sa regional targeting.Tungod sa mga problema sa in vivo imaging, ang pamatasan sa ingon nga gagmay nga mga partikulo sa magnetic sa ibabaw sa agianan sa hangin sa presensya sa usa ka gigamit nga magnetic field dili kaayo masabtan.Ang katuyoan sa kini nga pagtuon mao ang paggamit sa synchrotron imaging aron mahanduraw sa vivo ang paglihok sa usa ka serye sa mga magnetic nga partikulo sa trachea sa mga anesthetized nga ilaga aron matun-an ang dinamika ug mga sumbanan sa pamatasan sa usa ug kadaghanan nga mga partikulo sa vivo.Gisusi usab namo kung ang paghatud sa mga lentiviral magnetic nga mga partikulo sa presensya sa magnetic field makadugang sa kahusayan sa transduction sa trachea sa ilaga.Ang Synchrotron X-ray imaging nagpakita sa kinaiya sa mga magnetic particle sa naghunong ug naglihok nga magnetic field sa vitro ug in vivo.Ang mga partikulo dili dali nga maguyod tabok sa nawong sa buhi nga mga agianan sa hangin gamit ang mga magnet, apan sa panahon sa transportasyon, ang mga deposito gikonsentrar sa natad sa pagtan-aw, diin ang magnetic field labing kusog.Ang pagkaayo sa transduction nadugangan usab unom ka pilo kung ang mga lentiviral magnetic nga mga partikulo gihatag sa presensya sa usa ka magnetic field.Gihiusa, kini nga mga resulta nagsugyot nga ang lentiviral magnetic nga mga partikulo ug magnetic field mahimo’g hinungdanon nga mga pamaagi aron mapaayo ang pag-target sa vector sa gene ug lebel sa transduction sa mga conductive airways sa vivo.
Ang cystic fibrosis (CF) tungod sa mga kalainan sa usa ka gene nga gitawag ug CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Ang CFTR nga protina usa ka ion channel nga anaa sa daghang epithelial cells sa tibuok lawas, lakip na ang mga agianan sa hangin, usa ka dakong dapit sa pathogenesis sa cystic fibrosis.Ang mga depekto sa CFTR mosangpot sa abnormal nga transportasyon sa tubig, dehydration sa agianan sa hangin, ug pagkunhod sa airway surface fluid layer (ASL) nga giladmon.Gidaot usab niini ang katakus sa mucociliary transport (MCT) nga sistema sa paghawan sa mga agianan sa hangin sa mga inhaled nga partikulo ug mga pathogen.Ang among tumong mao ang paghimo og lentiviral (LV) gene therapy aron mahatagan ang saktong kopya sa CFTR gene ug mapausbaw ang ASL, MCT, ug kahimsog sa baga, ug ipadayon ang pagpalambo sa mga bag-ong teknolohiya nga makasukod niini nga mga parameter sa vivo1.
Ang mga LV vectors usa sa mga nanguna nga kandidato alang sa cystic fibrosis gene therapy, labi na tungod kay mahimo nila nga permanente nga i-integrate ang therapeutic gene sa mga basal cell sa agianan sa hangin (airway stem cells).Importante kini tungod kay mahimo nilang ibalik ang normal nga hydration ug mucus clearance pinaagi sa paglainlain ngadto sa functional gene-corrected airway surface cells nga may kalabutan sa cystic fibrosis, nga moresulta sa tibuok kinabuhi nga mga benepisyo.Ang LV vectors kinahanglang ipunting batok sa conductive airways, tungod kay dinhi magsugod ang pagkalambigit sa baga sa CF.Ang paghatod sa vector nga mas lawom ngadto sa baga mahimong moresulta sa alveolar transduction, apan kini walay therapeutic effect sa cystic fibrosis.Bisan pa, ang mga pluwido sama sa mga tagdala sa gene natural nga molalin ngadto sa alveoli kung mahawa human sa pagpanganak3,4 ug ang mga partikulo sa terapyutik paspas nga gipagawas sa oral cavity pinaagi sa mga MCT.Ang kaepektibo sa LV transduction direktang may kalabutan sa gidugayon sa panahon nga ang vector nagpabilin nga duol sa target nga mga selula aron tugotan ang cellular uptake - "panahon sa pagpuyo" 5 nga dali nga gipamub-an pinaagi sa tipikal nga regional airflow ingon man ang coordinated uptake sa mucus ug MCT nga mga partikulo.Alang sa cystic fibrosis, ang abilidad sa pagpalugway sa oras sa pagpuyo sa LV sa mga agianan sa hangin hinungdanon aron makab-ot ang taas nga lebel sa transduction sa kini nga lugar, apan hangtod karon mahagiton.
Aron mabuntog kini nga babag, among gisugyot nga ang LV magnetic particles (MPs) makatabang sa duha ka komplementaryong paagi.Una, mahimo silang magiyahan sa usa ka magnet sa ibabaw sa agianan sa hangin aron mapauswag ang pag-target ug matabangan ang mga partikulo sa carrier sa gene nga naa sa husto nga lugar sa agianan sa hangin;ug ASL) mobalhin ngadto sa lut-od sa selula 6. Ang mga MP kaylap nga gigamit isip gipunting nga mga sakyanan sa paghatod sa droga kon sila mogapos sa mga antibodies, chemotherapy nga mga tambal, o uban pang gagmayng molekula nga motapot sa mga membrana sa selula o mogapos sa ilang tagsa-tagsa ka mga selula sa ibabaw nga mga receptor ug magtigom sa mga dapit sa tumor sa presensya sa static nga kuryente.Magnetic field para sa cancer therapy 7. Ang ubang "hyperthermic" nga mga pamaagi gitumong sa pagpatay sa mga tumor cells pinaagi sa pagpainit sa mga MPs kung ma-expose sa oscillating magnetic fields.Ang prinsipyo sa magnetic transfection, diin ang magnetic field gigamit isip transfection agent aron mapalambo ang pagbalhin sa DNA ngadto sa mga selula, kasagarang gigamit sa vitro gamit ang lain-laing non-viral ug viral gene vectors para sa lisud nga transduce nga mga linya sa cell. ..Ang kaepektibo sa LV magnetotransfection uban ang paghatod sa LV MP in vitro ngadto sa usa ka cell line sa human bronchial epithelium sa presensya sa usa ka static magnetic field natukod, nga nagdugang sa efficiency sa transduction sa 186 ka beses kumpara sa LV vector lamang.Ang LV MT gigamit usab sa usa ka in vitro nga modelo sa cystic fibrosis, diin ang magnetic transfection nagdugang sa LV transduction sa air-liquid interface cultures sa usa ka factor nga 20 sa presensya sa cystic fibrosis sputum10.Bisan pa, sa vivo organ magnetotransfection nakadawat medyo gamay nga atensyon ug gisusi lamang sa pipila ka mga pagtuon sa hayop11,12,13,14,15, labi na sa baga16,17.Bisan pa, ang mga posibilidad sa magnetic transfection sa therapy sa baga sa cystic fibrosis klaro.Tan ug uban pa.(2020) nag-ingon nga "usa ka validation nga pagtuon sa epektibo nga pulmonary delivery sa magnetic nanoparticle maghatag dalan alang sa umaabot nga CFTR inhalation estratehiya aron sa pagpalambo sa clinical resulta sa mga pasyente uban sa cystic fibrosis"6.
Ang pamatasan sa gagmay nga mga partikulo sa magnetic sa ibabaw sa respiratory tract sa presensya sa usa ka gipadapat nga magnetic field lisud nga mahanduraw ug tun-an, ug busa sila dili kaayo masabtan.Sa ubang mga pagtuon, nakahimo kami og Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) nga pamaagi para sa non-invasive imaging ug quantification sa minuto sa vivo nga mga kausaban sa ASL18 depth ug MCT19 behavior,20 aron direktang masukod ang gas channel surface hydration ug gigamit ingon nga usa ka sayo nga timailhan sa pagkaepektibo sa pagtambal.Dugang pa, ang among pamaagi sa pag-iskor sa MCT naggamit sa 10-35 µm diameter nga mga partikulo nga gilangkoban sa alumina o taas nga refractive index nga bildo ingon nga mga marka sa MCT nga makita sa PB-PCXI21.Ang duha nga mga pamaagi angay alang sa pag-imaging sa lainlaing mga tipo sa partikulo, lakip ang mga MP.
Tungod sa taas nga spatial ug temporal nga resolusyon, ang among PB-PCXI nga nakabase sa ASL ug MCT assays haum kaayo sa pagtuon sa dynamics ug mga pattern sa pamatasan sa single ug bulk nga mga partikulo sa vivo aron matabangan kami nga masabtan ug ma-optimize ang mga pamaagi sa paghatud sa MP gene.Ang pamaagi nga among gigamit dinhi gibase sa among mga pagtuon gamit ang SPring-8 BL20B2 beamline, diin among gitan-aw ang fluid nga paglihok pagkahuman sa paghatud sa usa ka dosis sa usa ka dummy vector sa ilong ug pulmonary nga agianan sa mga ilaga aron makatabang sa pagpatin-aw sa among heterogeneous nga mga pattern sa ekspresyon sa gene nga naobserbahan. sa atong gene.mga pagtuon sa mananap nga adunay carrier nga dosis nga 3.4.
Ang katuyoan sa kini nga pagtuon mao ang paggamit sa PB-PCXI synchrotron aron mahanduraw ang mga paglihok sa vivo sa usa ka serye sa mga MP sa trachea sa mga buhi nga ilaga.Kini nga mga pagtuon sa imaging sa PB-PCXI gidisenyo aron sulayan ang serye sa MP, kusog sa magnetic field, ug lokasyon aron mahibal-an ang ilang epekto sa paglihok sa MP.Nagtuo kami nga ang usa ka eksternal nga magnetic field makatabang sa gihatag nga MF nga magpabilin o mobalhin sa target nga lugar.Gitugotan usab kami sa kini nga mga pagtuon nga mahibal-an ang mga pag-configure sa magnet nga nagpadako sa gidaghanon sa mga partikulo nga nahabilin sa trachea pagkahuman sa pagdeposito.Sa ikaduha nga serye sa mga pagtuon, gitumong namo nga gamiton kining labing maayo nga configuration aron ipakita ang transduction pattern nga resulta sa in vivo delivery sa LV-MPs ngadto sa rat airways, sa pagtuo nga ang paghatod sa LV-MPs sa konteksto sa airway targeting moresulta. sa dugang nga LV transduction efficiency..
Ang tanan nga mga pagtuon sa hayop gihimo subay sa mga protocol nga gi-aprubahan sa University of Adelaide (M-2019-060 ug M-2020-022) ug ang SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Ang mga eksperimento gihimo subay sa mga rekomendasyon sa ARRIVE.
Ang tanang x-ray nga mga hulagway gikuha sa BL20XU beamline sa SPring-8 synchrotron sa Japan gamit ang setup nga susama sa gihulagway kaniadto21,22.Sa mubo, ang kahon sa eksperimento nahimutang 245 m gikan sa singsing sa pagtipig sa synchrotron.Usa ka sample-to-detector nga gilay-on nga 0.6 m ang gigamit para sa particle imaging studies ug 0.3 m para sa in vivo imaging studies aron makamugna ug phase contrast effects.Usa ka monochromatic beam nga adunay kusog nga 25 keV ang gigamit.Ang mga hulagway nakuha gamit ang taas nga resolusyon nga X-ray transducer (SPring-8 BM3) nga giubanan sa usa ka sCMOS detector.Ang transducer nag-convert sa X-ray ngadto sa makita nga kahayag gamit ang 10 µm nga gibag-on nga scintillator (Gd3Al2Ga3O12), nga dayon idirekta ngadto sa sCMOS sensor gamit ang x10 (NA 0.3) nga tumong sa mikroskopyo.Ang sCMOS detector kay usa ka Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) nga adunay array nga gidak-on nga 2048 × 2048 pixels ug usa ka hilaw nga pixel nga gidak-on nga 6.5 × 6.5 µm.Kini nga setting naghatag ug epektibong isotropic pixel nga gidak-on nga 0.51 µm ug usa ka field of view nga gibana-bana nga 1.1 mm × 1.1 mm.Ang gidugayon sa pagkaladlad sa 100 ms gipili aron mapadako ang signal-to-noise ratio sa mga magnetic nga partikulo sa sulod ug gawas sa mga agianan sa hangin samtang gipamubu ang mga artifact sa paglihok tungod sa pagginhawa.Alang sa mga pagtuon sa vivo, usa ka paspas nga X-ray shutter ang gibutang sa X-ray nga agianan aron limitahan ang dosis sa radiation pinaagi sa pagbabag sa X-ray beam taliwala sa mga exposure.
Ang LV media wala gigamit sa bisan unsang SPring-8 PB-PCXI imaging studies tungod kay ang BL20XU imaging chamber dili Biosafety Level 2 certified.Hinunoa, gipili namo ang usa ka lain-laing mga maayo nga kinaiya nga MPs gikan sa duha ka komersyal nga vendors nga naglangkob sa usa ka lain-laing mga gidak-on, mga materyales, puthaw konsentrasyon, ug mga aplikasyon , - una aron masabtan kon sa unsang paagi ang magnetic field makaapekto sa paglihok sa mga MPs sa bildo capillaries, ug unya sa buhi nga mga agianan sa hangin.ibabaw.Ang gidak-on sa MP lainlain gikan sa 0.25 hangtod 18 µm ug gihimo gikan sa lainlaing mga materyales (tan-awa ang Talaan 1), apan ang komposisyon sa matag sample, lakip ang gidak-on sa mga magnetic particle sa MP, wala mahibal-an.Base sa among halapad nga pagtuon sa MCT 19, 20, 21, 23, 24, among gipaabot nga ang mga MPs hangtod sa 5 µm makita sa tracheal airway surface, pananglitan, pinaagi sa pagkub-ot sa sunud-sunod nga mga frame aron makita ang mas maayo nga visibility sa MP movement.Ang usa ka MP nga 0.25 µm mas gamay kay sa resolusyon sa imaging device, apan ang PB-PCXI gilauman nga makamatikod sa ilang volumetric contrast ug sa paglihok sa nawong nga likido diin kini gideposito human ma-deposito.
Mga sampol alang sa matag MP sa lamesa.1 giandam sa 20 μl glass capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) nga adunay internal diameter nga 0.63 mm.Ang mga partikulo sa corpuscular anaa sa tubig, samtang ang mga partikulo sa CombiMag anaa sa proprietary liquid sa tiggama.Ang matag tubo gipuno sa katunga sa likido (gibana-bana nga 11 µl) ug gibutang sa sample holder (tan-awa ang Figure 1).Ang mga capillaries sa bildo gibutang nga pinahigda sa entablado sa imaging chamber, matag usa, ug gibutang sa mga ngilit sa likido.Usa ka 19 mm diametro (28 mm ang gitas-on) nickel-shell magnet nga hinimo sa talagsaon nga yuta, neodymium, puthaw ug boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) uban sa usa ka remanence sa 1.17 T ang gilakip sa usa ka bulag nga lamesa sa pagbalhin aron makab-ot Ang layo nga pagbag-o sa imong posisyon sa panahon sa paghubad.Ang X-ray imaging magsugod kung ang magnet gipahimutang sa gibana-bana nga 30 mm sa ibabaw sa sample ug ang mga imahe makuha sa 4 nga mga frame matag segundo.Atol sa imaging, ang magnet gipaduol sa glass capillary tube (sa gilay-on nga mga 1 mm) ug dayon gibalhin sa tubo aron masusi ang epekto sa kusog ug posisyon sa uma.
Usa ka in vitro imaging setup nga adunay sulod nga MP sample sa glass capillaries sa yugto sa paghubad sa xy sample.Ang agianan sa X-ray beam gimarkahan og pula nga tuldok nga linya.
Kung natukod ang in vitro visibility sa mga MP, usa ka subset niini ang gisulayan sa vivo sa wild-type nga babaye nga Wistar albino nga mga ilaga (~ 12 ka semana ang edad, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) ug butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Ang mga ilaga gi-anesthetize sa Pharma (Japan) nga sagol pinaagi sa intraperitoneal injection.Human sa anesthesia, sila giandam alang sa imaging pinaagi sa pagtangtang sa balhibo sa palibot sa trachea, pagsal-ot sa usa ka endotracheal tube (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), ug immobilizing sila sa supine nga posisyon sa usa ka custom-made imaging plate nga adunay usa ka thermal bag. aron mapadayon ang temperatura sa lawas.22. Ang imaging plate dayon gilakip sa sample stage sa imaging box sa gamay nga anggulo aron ipahiangay ang trachea nga pinahigda sa x-ray nga imahe sama sa gipakita sa Figure 2a.
(a) In vivo imaging setup sa SPring-8 imaging unit, X-ray beam path nga gimarkahan og pula nga tuldok nga linya.(b, c) Ang lokalisasyon sa tracheal magnet gihimo sa layo gamit ang duha ka orthogonally mounted IP camera.Sa wala nga bahin sa hulagway sa screen, imong makita ang wire loop nga nagkupot sa ulo ug ang delivery cannula nga gibutang sa sulod sa ET tube.
Usa ka remote controlled syringe pump system (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gamit ang 100 µl glass syringe gikonektar sa PE10 tubing (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) gamit ang 30 Ga needle.Markahi ang tubo aron masiguro nga ang tumoy naa sa saktong posisyon sa trachea kung isulod ang endotracheal tube.Gamit ang micropump, gikuha ang syringe plunger ug ang tumoy sa tubo giunlod sa MP sample nga ihatod.Ang gikarga nga tubo sa pagpadala dayon gisulod sa endotracheal tube, nga gibutang ang tumoy sa pinakalig-on nga bahin sa among gipaabot nga magnetic field.Ang pagkuha sa imahe gikontrol gamit ang breath detector nga konektado sa among Arduino-based timing box, ug ang tanang signal (pananglitan, temperatura, respiration, shutter open/close, ug image acquisition) girekord gamit ang Powerlab ug LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Sa diha nga Imaging Sa diha nga ang housing wala magamit, duha ka IP camera (Panasonic BB-SC382) gipahimutang sa gibana-bana nga 90 ° sa usag usa ug gigamit sa pagkontrolar sa posisyon sa magnet kalabot sa trachea sa panahon sa imaging (Figure 2b, c).Aron maminusan ang mga artifact sa paglihok, usa ka imahe matag gininhawa ang nakuha sa panahon sa terminal respiratory flow plateau.
Ang magnet gilakip sa ikaduhang yugto, nga mahimong nahimutang sa layo sa gawas sa lawas sa imaging.Gisulayan ang lainlaing mga posisyon ug mga pag-configure sa magnet, lakip ang: gibutang sa anggulo nga gibana-bana nga 30 ° sa ibabaw sa trachea (gipakita ang mga pag-configure sa Mga Figure 2a ug 3a);usa ka magnet sa ibabaw sa mananap ug ang usa sa ubos, nga ang mga poste gibutang para sa atraksyon (Figure 3b)., usa ka magnet sa ibabaw sa mananap ug usa sa ubos, nga ang mga poste gibutang para sa pagbalibad (Figure 3c), ug usa ka magnet sa ibabaw ug tul-id sa trachea (Figure 3d).Human sa pagpahimutang sa mananap ug magnet ug pagkarga sa MP ubos sa pagsulay ngadto sa syringe pump, paghatag ug dosis nga 50 µl sa gikusgon nga 4 µl/sec sa pagkuha sa mga hulagway.Dayon ang magnet ibalhin balik-balik subay o tabok sa trachea samtang nagpadayon sa pagkuha og mga hulagway.
Magnet configuration para sa in vivo imaging (a) usa ka magnet sa ibabaw sa trachea sa anggulo nga gibana-bana nga 30°, (b) duha ka magnet nga gi-configure para sa atraksyon, (c) duha ka magnet nga gi-configure para sa repulsion, (d) usa ka magnet sa ibabaw ug perpendicular sa trachea.Ang tigpaniid mitan-aw gikan sa baba ngadto sa baga pinaagi sa trachea ug ang X-ray beam miagi sa wala nga bahin sa ilaga ug migawas sa tuo nga bahin.Ang magnet mahimong ibalhin subay sa gitas-on sa agianan sa hangin o wala ug tuo sa ibabaw sa trachea sa direksyon sa X-ray beam.
Gitinguha usab namon nga mahibal-an ang panan-aw ug pamatasan sa mga partikulo sa mga agianan sa hangin kung wala’y pagsagol sa respiration ug rate sa kasingkasing.Busa, sa pagtapos sa panahon sa imaging, ang mga mananap gi-euthanize sa tawo tungod sa overdose sa pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Ang ubang mga mananap gibilin sa plataporma sa imaging, ug human sa paghunong sa pagginhawa ug pagpitik sa kasingkasing, ang proseso sa imaging gisubli, nga nagdugang og dugang nga dosis sa MP kon walay MP nga makita sa ibabaw sa agianan sa hangin.
Ang resulta nga mga hulagway gitul-id para sa patag ug ngitngit nga uma ug dayon gitigom ngadto sa usa ka salida (20 ka frame kada segundo; 15–25 × normal nga gikusgon depende sa respiration rate) gamit ang custom script nga gisulat sa MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Ang tanan nga mga pagtuon sa LV gene vector delivery gihimo sa University of Adelaide Laboratory Animal Research Center ug gitumong sa paggamit sa mga resulta sa SPring-8 nga eksperimento aron masusi kung ang LV-MP nga paghatud sa presensya sa magnetic field makapauswag sa pagbalhin sa gene sa vivo .Aron masusi ang mga epekto sa MF ug magnetic field, duha ka grupo sa mga mananap ang gitambalan: ang usa ka grupo gi-injected sa LV MF nga adunay magnet placement, ug ang laing grupo gi-injected sa control group nga adunay LV MF nga walay magnet.
Ang LV gene vectors namugna gamit ang naunang gihulagway nga mga pamaagi 25, 26 .Ang LacZ vector nagpahayag sa usa ka nukleyar nga lokal nga beta-galactosidase gene nga gimaneho sa MPSV constitutive promoter (LV-LacZ), nga nagpatunghag asul nga produkto sa reaksyon sa transduced nga mga selula, nga makita sa atubangan ug mga seksyon sa tissue sa baga.Ang titration gihimo sa mga kultura sa selula pinaagi sa pag-ihap sa gidaghanon sa mga selula nga positibo sa LacZ gamit ang hemocytometer aron makalkulo ang titer sa TU/ml.Ang mga carrier gi-cryopreserve sa -80°C, natunaw sa wala pa gamiton, ug gigapos sa CombiMag pinaagi sa pagsagol sa 1:1 ug paglumlum sa yelo sulod sa labing menos 30 ka minuto sa wala pa ipadala.
Normal nga Sprague Dawley nga mga ilaga (n = 3/grupo, ~ 2-3 anesthetized ip nga adunay sagol nga 0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) ug 60mg/kg ketamine (Ilium, Australia) sa 1 ka bulan nga edad) ip ) injection ug non-surgical oral cannulation nga adunay 16 Ga intravenous cannula.Aron masiguro nga ang tracheal airway tissue makadawat sa LV transduction, kini gikondisyon gamit ang among gihulagway nga mechanical perturbation protocol diin ang tracheal airway surface gihaplasan sa axially gamit ang wire basket (N-Circle, nitinol stone extractor nga walay tip NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Pagkahuman, mga 10 minuto pagkahuman sa pagkagubot sa kabinete sa biosafety, gihimo ang tracheal nga administrasyon sa LV-MP.
Ang magnetic field nga gigamit niini nga eksperimento gi-configure parehas sa usa ka in vivo x-ray nga pagtuon, nga adunay parehas nga mga magnet nga gikuptan sa trachea nga adunay distillation stent clamps (Figure 4).Usa ka 50 µl volume (2 x 25 µl aliquots) sa LV-MP ang gihatag ngadto sa trachea (n = 3 ka mananap) gamit ang gel-tipped pipette sama sa gihulagway kaniadto.Ang kontrol nga grupo (n = 3 nga mga hayop) nakadawat sa parehas nga LV-MP nga wala gigamit ang usa ka magnet.Human sa pagkompleto sa pagpuga, ang cannula gikuha gikan sa endotracheal tube ug ang mananap extubated.Ang magnet nagpabilin sa lugar sulod sa 10 ka minuto sa wala pa makuha.Ang mga ilaga gi-dosed subcutaneously sa meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) gisundan sa anesthesia withdrawal pinaagi sa intraperitoneal injection sa 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Ang mga ilaga gipainit ug gibantayan hangtod hingpit nga naayo gikan sa anesthesia.
LV-MP delivery device sa usa ka biological safety cabinet.Imong makita nga ang gaan nga abohon nga Luer-lock nga manggas sa ET tube mogawas gikan sa baba, ug ang gel pipette tip nga gipakita sa numero gisal-ut pinaagi sa ET tube ngadto sa gitinguha nga giladmon ngadto sa trachea.
Usa ka semana human sa pamaagi sa pagdumala sa LV-MP, ang mga mananap tawhanon nga gisakripisyo pinaagi sa inhalation sa 100% CO2 ug ang LacZ nga ekspresyon gi-assess gamit ang among standard X-gal treatment.Ang tulo ka labing caudal cartilage singsing gikuha aron sa pagsiguro nga ang bisan unsa nga mekanikal nga kadaot o fluid retention tungod sa endotracheal tube placement dili iapil sa pagtuki.Ang matag trachea giputol sa gitas-on aron makakuha og duha ka katunga alang sa pagtuki ug gibutang sa usa ka tasa nga adunay silicone nga goma (Sylgard, Dow Inc) gamit ang usa ka Minutien needle (Fine Science Tools) aron mahanduraw ang luminal surface.Ang pag-apod-apod ug kinaiya sa mga transduced nga mga selula gipamatud-an sa frontal photography gamit ang Nikon microscope (SMZ1500) nga adunay DigiLite camera ug TCapture software (Tucsen Photonics, China).Ang mga hulagway nakuha sa 20x nga pagpadako (lakip na ang pinakataas nga setting alang sa tibuok gilapdon sa trachea), nga ang tibuok nga gitas-on sa trachea gipakita sa hinay-hinay, nga naghatag og igong pagsapaw tali sa matag hulagway aron tugotan ang mga hulagway nga "gitahi".Ang mga hulagway gikan sa matag trachea gihiusa dayon ngadto sa usa ka composite image gamit ang Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) gamit ang planar motion algorithm. Ang lugar sa LacZ nga ekspresyon sulod sa tracheal composite nga mga hulagway gikan sa matag mananap gi-quantified gamit ang automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto28, gamit ang mga setting sa 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ug Value <0.7. Ang lugar sa LacZ nga ekspresyon sulod sa tracheal composite nga mga hulagway gikan sa matag mananap gi-quantified gamit ang automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto28, gamit ang mga setting sa 0.35 <Hue <0.58, Saturation> 0.15, ug Value <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Ang lugar sa LacZ nga ekspresyon sa composite tracheal nga mga imahe gikan sa matag hayop gi-quantified gamit ang automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto28 gamit ang mga setting sa 0.350.15 ug bili <0.7.如 前所 述, 使用 自动 Matlab 脚本 (R2020A, Mathworks) 对对 的 气管气管 的量化 的 的 Lacz 表达表达 中 的. .. . . . . . . . . . . . . . . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Ang mga lugar sa LacZ nga ekspresyon sa composite nga mga hulagway sa trachea sa matag mananap gi-quantified gamit ang automated MATLAB script (R2020a, MathWorks) sama sa gihulagway kaniadto gamit ang mga setting sa 0.35 < hue <0.58, saturation> 0.15 ug value <0.7.Pinaagi sa pagsubay sa mga contour sa tisyu sa GIMP v2.10.24, usa ka maskara ang gihimo nga mano-mano alang sa matag composite nga imahe aron mailhan ang lugar sa tisyu ug mapugngan ang bisan unsang sayup nga pagkakita sa gawas sa tracheal tissue.Ang mga namansahan nga dapit gikan sa tanang composite nga mga hulagway gikan sa matag mananap gisumada aron mahatagan ang kinatibuk-ang buling nga dapit alang sa maong mananap.Ang gipintalan nga lugar dayon gibahin sa kinatibuk-ang lugar sa maskara aron makakuha usa ka normal nga lugar.
Ang matag trachea gibutang sa paraffin ug gibahin ang gibag-on nga 5 µm.Ang mga seksyon gi-counterstain nga adunay neutral nga paspas nga pula sa 5 nga mga minuto ug nakuha ang mga imahe gamit ang usa ka mikroskopyo sa Nikon Eclipse E400, camera sa DS-Fi3 ug software sa pagkuha sa elemento sa NIS (bersyon 5.20.00).
Ang tanan nga istatistikal nga pagtuki gihimo sa GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Ang kahulogan sa estadistika gitakda sa p ≤ 0.05.Ang normalidad gisulayan gamit ang Shapiro-Wilk test ug ang mga kalainan sa LacZ staining gisusi gamit ang unpaired t-test.
Ang unom ka MPs nga gihulagway sa Table 1 gisusi sa PCXI, ug ang visibility gihulagway sa Table 2. Duha ka polystyrene MPs (MP1 ug MP2; 18 µm ug 0.25 µm, matag usa) dili makita sa PCXI, apan ang nahabilin nga mga sample mahimong mailhan. (mga pananglitan gipakita sa Figure 5).Ang MP3 ug MP4 huyang nga makita (10-15% Fe3O4; 0.25 µm ug 0.9 µm, matag usa).Bisan tuod ang MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) adunay pipila sa pinakagamay nga mga partikulo nga gisulayan, kini mao ang labing gipahayag.Ang produkto sa CombiMag MP6 lisud mailhan.Sa tanan nga mga kaso, ang among abilidad sa pag-ila sa mga MF gipauswag pag-ayo pinaagi sa paglihok sa magnet pabalik-balik nga parallel sa capillary.Samtang ang mga magnet mibalhin gikan sa capillary, ang mga partikulo gibira sa taas nga mga kadena, apan samtang ang mga magnet nagkaduol ug ang magnetic field kusog misaka, ang mga particle nga kadena gipamub-an samtang ang mga partikulo migrate paingon sa ibabaw nga nawong sa capillary (tan-awa ang Supplemental Video S1 : MP4), pagdugang sa density sa partikulo sa ibabaw.Sa kasukwahi, kung ang magnet gikuha gikan sa capillary, ang kusog sa uma mikunhod ug ang mga MP naghan-ay pag-usab ngadto sa taas nga mga kadena gikan sa ibabaw nga bahin sa capillary (tan-awa ang Supplementary Video S2: MP4).Human mohunong sa paglihok ang magnet, ang mga partikulo magpadayon sa paglihok sulod sa pipila ka panahon human makaabot sa posisyon sa panimbang.Samtang ang MP naglihok padulong ug palayo gikan sa ibabaw nga bahin sa capillary, ang mga magnetic nga partikulo lagmit nga magkuha sa mga tinumpag pinaagi sa likido.
Ang visibility sa MP ubos sa PCXI magkalahi kaayo tali sa mga sample.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6.Ang tanan nga mga imahe nga gipakita dinhi gikuha gamit ang usa ka magnet nga gipahimutang nga gibana-bana nga 10 mm direkta sa ibabaw sa capillary.Ang dayag nga dagkong mga lingin mao ang mga bula sa hangin nga natanggong sa mga capillary, nga tin-aw nga nagpakita sa itom ug puti nga mga bahin sa kilid sa hulagway sa kalainan sa hugna.Ang pula nga kahon nagpaila sa pagpadako nga nagpadako sa kalainan.Timan-i nga ang mga diametro sa magnet circuits sa tanan nga mga numero dili sukdon ug gibana-bana nga 100 ka pilo nga mas dako kaysa gipakita.
Samtang ang magnet molihok sa wala ug tuo ubay sa ibabaw sa capillary, ang anggulo sa MP string mausab aron ipahiangay sa magnet (tan-awa ang Figure 6), sa ingon naghulagway sa mga linya sa magnetic field.Alang sa MP3-5, human ang chord makaabot sa anggulo sa threshold, ang mga partikulo mag-drag sa ibabaw nga bahin sa capillary.Kini kasagarang moresulta sa paghugpong sa mga MP ngadto sa mas dagkong mga grupo duol sa diin ang magnetic field maoy labing kusog (tan-awa ang Supplementary Video S3: MP5).Kini mao usab ang ilabi na nga dayag sa diha nga imaging duol sa katapusan sa capillary, nga maoy hinungdan sa MP sa aggregate ug concentrate sa liquid-air interface.Ang mga partikulo sa MP6, nga mas lisud mailhan kay sa mga naa sa MP3-5, wala mag-drag sa dihang ang magnet milihok subay sa capillary, apan ang mga kuwerdas sa MP nagbulag, nga gibiyaan ang mga partikulo nga makita (tan-awa ang Supplementary Video S4: MP6).Sa pipila ka mga kaso, kung ang gipadapat nga magnetic field gikunhoran pinaagi sa pagbalhin sa magnet sa layo nga gilay-on gikan sa imaging site, ang bisan unsang nahabilin nga mga MP hinayhinay nga nanaog sa ilawom nga bahin sa tubo pinaagi sa grabidad, nagpabilin sa hilo (tan-awa ang Supplementary Video S5: MP3) .
Ang anggulo sa MP string mausab samtang ang magnet mobalhin sa tuo ibabaw sa capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ug (d) MP6.Ang pula nga kahon nagpaila sa pagpadako nga nagpadako sa kalainan.Palihug timan-i nga ang dugang nga mga video kay para sa mga katuyoan sa impormasyon samtang kini nagpadayag sa importante nga istruktura sa partikulo ug dinamikong impormasyon nga dili makita niining mga static nga mga hulagway.
Gipakita sa among mga pagsulay nga ang paglihok sa magnet pabalik-balik nga hinay sa trachea nagpadali sa pagtan-aw sa MF sa konteksto sa komplikado nga paglihok sa vivo.Walay in vivo nga mga pagsulay nga gihimo tungod kay ang polystyrene beads (MP1 ug MP2) dili makita sa capillary.Ang matag usa sa nahabilin nga upat ka MF gisulayan sa vivo nga adunay taas nga axis sa magnet nga gipahimutang sa ibabaw sa trachea sa usa ka anggulo nga mga 30 ° hangtod sa bertikal (tan-awa ang Mga Figure 2b ug 3a), tungod kay miresulta kini sa mas taas nga mga kadena sa MF ug labi ka epektibo. kay sa magnet..gitapos ang configuration.Ang MP3, MP4 ug MP6 wala makit-an sa trachea sa bisan unsang buhi nga mga hayop.Kung i-visualize ang respiratory tract sa mga ilaga human sa tawhanon nga pagpatay sa mga hayop, ang mga partikulo nagpabilin nga dili makita bisan kung ang dugang nga volume gidugang gamit ang syringe pump.Ang MP5 adunay labing taas nga sulud sa iron oxide ug mao ra ang makita nga partikulo, mao nga gigamit kini sa pagtimbang-timbang ug pag-ila sa pamatasan sa MP sa vivo.
Ang pagbutang sa magnet ibabaw sa trachea sa panahon sa pagsal-ot sa MF miresulta sa daghan, apan dili tanan, ang mga MF nga nakonsentrar sa natad sa panglantaw.Ang pagsulod sa tracheal sa mga partikulo labing maayo nga makita sa tawhanon nga euthanized nga mga hayop.Figure 7 ug Supplementary Video S6: Ang MP5 nagpakita sa paspas nga magnetic capture ug pag-align sa mga partikulo sa ibabaw sa ventral trachea, nga nagpakita nga ang mga MP mahimong mapuntirya sa gusto nga mga lugar sa trachea.Kung nangita sa labi ka layo sa trachea pagkahuman sa paghatud sa MF, ang pipila nga mga MF nakit-an nga mas duol sa carina, nga nagpaila sa dili igo nga kusog sa magnetic field aron makolekta ug mahuptan ang tanan nga mga MF, tungod kay kini gihatud sa rehiyon nga adunay labing kadaghan nga kusog sa magnetic field sa panahon sa pagdumala sa likido.proseso.Bisan pa, ang mga konsentrasyon sa postnatal MP mas taas sa palibot sa lugar sa imahe, nga nagsugyot nga daghang mga MP ang nagpabilin sa mga rehiyon sa agianan sa hangin diin ang gigamit nga kusog sa magnetic field labing taas.
Mga hulagway sa (a) sa wala pa ug (b) human sa paghatud sa MP5 ngadto sa trachea sa bag-o lang na-euthanized nga ilaga nga adunay magnet nga gibutang ibabaw lang sa lugar sa imaging.Ang gihulagway nga dapit nahimutang sa taliwala sa duha ka cartilaginous singsing.Adunay pipila ka likido sa mga agianan sa hangin sa wala pa ihatud ang MP.Ang pula nga kahon nagpaila sa pagpadako nga nagpadako sa kalainan.Kini nga mga hulagway gikuha gikan sa video nga gipakita sa S6: MP5 Supplementary Video.
Ang paglihok sa magnet subay sa trachea sa vivo miresulta sa pagbag-o sa anggulo sa MP chain sa ibabaw sa agianan sa hangin, susama sa nakita sa mga capillary (tan-awa ang Figure 8 ug Supplementary Video S7: MP5).Bisan pa, sa among pagtuon, ang mga MP dili madala sa ibabaw sa buhi nga respiratory tract, sama sa mahimo sa mga capillary.Sa pipila ka mga kaso, ang kadena sa MP molugway samtang ang magnet molihok sa wala ug tuo.Makapainteres, nahibal-an usab namon nga ang kadena sa partikulo nagbag-o sa giladmon sa sulud sa sulud sa likido kung ang magnet gibalhin sa longitudinally ubay sa trachea, ug gipalapad kung ang magnet gibalhin direkta sa ibabaw ug ang kadena sa partikulo gituyok sa usa ka bertikal nga posisyon (tan-awa ang Dugang nga Video S7).: MP5 sa 0:09, ubos sa tuo).Ang kinaiya nga pattern sa paglihok nausab sa dihang ang magnet gibalhin sa kilid sa ibabaw sa trachea (ie, sa wala o tuo sa mananap, imbes sa gitas-on sa trachea).Ang mga partikulo klaro gihapon nga makita sa panahon sa ilang paglihok, apan sa dihang ang magnet gikuha gikan sa trachea, ang mga tumoy sa mga kuwerdas sa particle nahimong makita (tan-awa ang Supplementary Video S8: MP5, sugod sa 0:08).Nahiuyon kini sa naobserbahan nga kinaiya sa magnetic field ubos sa aksyon sa usa ka gipadapat nga magnetic field sa usa ka glass capillary.
Sample nga mga hulagway nga nagpakita sa MP5 sa trachea sa usa ka buhi nga anesthetized nga ilaga.(a) Ang magnet gigamit sa pagkuha og mga hulagway sa ibabaw ug sa wala sa trachea, unya (b) human sa pagbalhin sa magnet sa tuo.Ang pula nga kahon nagpaila sa pagpadako nga nagpadako sa kalainan.Kini nga mga hulagway gikan sa video nga gipakita sa S7's Supplementary Video: MP5.
Sa diha nga ang duha ka mga poste gipahiangay sa usa ka amihanan-habagatan nga oryentasyon sa ibabaw ug sa ubos sa trachea (ie, pagdani; Fig. 3b), ang mga MP chords nagpakita nga mas taas ug nahimutang sa lateral nga bungbong sa trachea kay sa ibabaw sa dorsal ibabaw sa trachea (tan-awa ang Apendise).Video S9:MP5).Bisan pa, ang taas nga konsentrasyon sa mga partikulo sa usa ka site (ie, ang dorsal nga nawong sa trachea) wala mahibal-an pagkahuman sa pagdumala sa likido gamit ang usa ka aparato nga doble nga magnet, nga sagad mahitabo sa usa ka aparato nga magnet.Unya, sa diha nga ang usa ka magnet gi-configure aron sa pagsalikway sa kaatbang nga mga poste (Figure 3c), ang gidaghanon sa mga partikulo nga makita sa natad sa panglantaw wala modaghan human sa delivery.Ang pag-set up sa duha ka mga pag-configure sa magnet lisud tungod sa taas nga kusog sa magnetic field nga nagdani o nagduso sa mga magnet.Ang setup dayon giusab ngadto sa usa ka magnet nga parallel sa mga agianan sa hangin apan moagi sa mga agianan sa hangin sa usa ka 90 degree nga anggulo aron ang mga linya sa pwersa mitabok sa tracheal nga bungbong sa orthogonally (Figure 3d), usa ka orientasyon nga gituyo aron mahibal-an ang posibilidad sa pagtipon sa particle sa ang lateral wall.maobserbahan.Bisan pa, sa kini nga pagsumpo, wala’y nahibal-an nga paglihok sa pagtipon sa MF o paglihok sa magnet.Base sa tanan niini nga mga resulta, ang usa ka configuration nga adunay usa ka magnet ug usa ka 30-degree nga oryentasyon ang gipili alang sa mga pagtuon sa vivo sa gene carriers (Fig. 3a).
Sa diha nga ang mananap gihulagway sa makadaghang higayon diha-diha dayon human sa tawhanon nga pagsakripisyo, ang pagkawala sa makabalda nga tissue motion nagpasabot nga ang mas maayo, mas mugbo nga mga linya sa partikulo mahimong mailhan sa tin-aw nga intercartilaginous field, 'pag-uyog' subay sa translational motion sa magnet.tin-aw nga makita ang presensya ug paglihok sa mga partikulo sa MP6.
Ang titer sa LV-LacZ maoy 1.8 x 108 IU/mL, ug human sa pagsagol sa 1:1 sa CombiMag MP (MP6), ang mga mananap giindyeksyon ug 50 µl sa tracheal dose nga 9 x 107 IU/ml sa LV nga sakyanan (ie 4.5 x 106 TU/rat).)).Sa kini nga mga pagtuon, imbis nga ibalhin ang magnet sa panahon sa paghago, among giayo ang magnet sa usa ka posisyon aron mahibal-an kung ang LV transduction mahimo (a) mapauswag kung itandi sa paghatud sa vector kung wala ang magnetic field, ug (b) kung ang agianan sa hangin mahimo magpokus.Ang mga selula nga gibalhin sa magnetic target nga mga lugar sa ibabaw nga respiratory tract.
Ang presensya sa mga magnet ug ang paggamit sa CombiMag inubanan sa LV vectors dili makita nga makadaot sa kahimsog sa hayop, sama sa among standard nga LV vector delivery protocol.Ang atubangan nga mga hulagway sa tracheal nga rehiyon nga gipailalom sa mekanikal nga perturbation (Supplementary Fig. 1) nagpakita nga ang LV-MP nga gitambalan nga grupo adunay mas taas nga lebel sa transduction sa presensya sa usa ka magnet (Fig. 9a).Usa ra ka gamay nga kantidad sa asul nga LacZ nga pag-stain ang naa sa control group (Figure 9b).Ang gidaghanon sa X-Gal-stained normalized nga mga rehiyon nagpakita nga ang pagdumala sa LV-MP sa presensya sa usa ka magnetic field miresulta sa gibana-bana nga 6-fold nga pag-uswag (Fig. 9c).
Pananglitan sa composite nga mga hulagway nga nagpakita sa tracheal transduction nga adunay LV-MP (a) sa presensya sa magnetic field ug (b) sa pagkawala sa magnet.(c) Mahinungdanon nga pag-uswag sa istatistika sa normal nga lugar sa LacZ transduction sa trachea gamit ang usa ka magnet (*p = 0.029, t-test, n = 3 matag grupo, mean ± standard error sa mean).
Ang mga neutral nga paspas nga pula nga mga seksyon (pananglitan nga gipakita sa Supplementary Fig. 2) nagpakita nga ang LacZ-stained cells anaa sa samang sample ug sa samang lokasyon sama sa gitaho kaniadto.
Ang yawe nga hagit sa airway gene therapy nagpabilin nga tukma nga lokalisasyon sa mga partikulo sa carrier sa mga lugar nga interesado ug ang pagkab-ot sa taas nga lebel sa transduction efficiency sa mobile lung sa presensya sa airflow ug aktibong mucus clearance.Alang sa mga carrier sa LV nga gituyo alang sa pagtambal sa mga sakit sa respiratoryo sa cystic fibrosis, ang pagdugang sa oras sa pagpuyo sa mga partikulo sa carrier sa conductive airways hangtod karon usa ka dili makab-ot nga katuyoan.Sama sa gipunting ni Castellani et al., Ang paggamit sa magnetic field aron mapalambo ang transduction adunay mga bentaha sa ubang mga pamaagi sa paghatud sa gene sama sa electroporation tungod kay mahimo kini nga maghiusa sa kayano, ekonomiya, lokal nga paghatud, dugang nga kahusayan, ug mas mubo nga oras sa paglumlum.ug posibleng mas ubos nga dosis sa sakyanan10.Bisan pa, sa vivo deposition ug kinaiya sa magnetic nga mga partikulo sa mga agianan sa hangin ubos sa impluwensya sa mga eksternal nga magnetic nga pwersa wala pa gayud gihulagway, ug sa pagkatinuod ang abilidad niini nga pamaagi sa pagdugang sa lebel sa ekspresyon sa gene sa intact buhi nga mga agianan sa hangin wala gipakita sa vivo.
Ang among in vitro nga mga eksperimento sa PCXI synchrotron nagpakita nga ang tanan nga mga partikulo nga among gisulayan, gawas sa MP polystyrene, makita sa imaging setup nga among gigamit.Sa presensya sa usa ka magnetic field, ang mga magnetic field nagporma og mga kuwerdas, ang gitas-on niini nalangkit sa matang sa mga partikulo ug ang kusog sa magnetic field (ie, ang kaduol ug paglihok sa magnet).Ingon sa gipakita sa Figure 10, ang mga kuwerdas nga atong nakita naporma samtang ang matag indibidwal nga partikulo nahimong magnetized ug nag-aghat sa kaugalingon nga lokal nga magnetic field.Kining bulag nga mga natad maoy hinungdan sa ubang susama nga mga partikulo sa pagkolekta ug pagkonektar sa mga lihok sa mga string sa grupo tungod sa mga lokal nga pwersa gikan sa lokal nga pwersa sa atraksyon ug pagsalikway sa ubang mga partikulo.
Diagram nga nagpakita sa (a, b) mga kadena sa mga partikulo nga naporma sulod sa mga capillary nga puno sa pluwido ug (c, d) usa ka trachea nga puno sa hangin.Timan-i nga ang mga capillary ug trachea wala madani sa sukod.Ang panel (a) usab adunay usa ka paghulagway sa MF nga adunay Fe3O4 nga mga partikulo nga gihan-ay sa mga kadena.
Sa diha nga ang magnet mibalhin sa ibabaw sa capillary, ang anggulo sa particle string nakaabot sa kritikal nga threshold alang sa MP3-5 nga adunay Fe3O4, human niini ang particle string wala na magpabilin sa orihinal nga posisyon niini, apan mibalhin sa ibabaw sa usa ka bag-ong posisyon.magnet.Kini nga epekto lagmit mahitabo tungod kay ang nawong sa bildo nga capillary igo nga hapsay aron tugotan kini nga paglihok nga mahitabo.Makapainteres, ang MP6 (CombiMag) wala maggawi niining paagiha, tingali tungod kay ang mga partikulo mas gamay, adunay lain nga coating o surface charge, o ang proprietary carrier fluid nakaapekto sa ilang abilidad sa paglihok.Ang kalainan sa hulagway sa partikulo sa CombiMag mas huyang usab, nga nagsugyot nga ang likido ug mga partikulo mahimong adunay parehas nga densidad ug busa dili dali nga molihok sa usag usa.Ang mga partikulo mahimo usab nga maipit kung ang magnet molihok nga kusog kaayo, nga nagpakita nga ang kusog sa magnetic field dili kanunay makabuntog sa friction tali sa mga partikulo sa likido, nga nagsugyot nga ang kusog sa magnetic field ug ang distansya tali sa magnet ug ang target nga lugar kinahanglan dili moabut ingon usa ka katingala.importante.Kini nga mga resulta nagpakita usab nga bisan og ang mga magnet makadakop ug daghang microparticle nga nagdagayday sa target nga lugar, dili tingali nga ang mga magnet mahimong masaligan sa paglihok sa mga partikulo sa CombiMag sa ibabaw sa trachea.Sa ingon, nakahinapos kami nga sa mga pagtuon sa vivo LV MF kinahanglan mogamit mga static nga magnetic field aron pisikal nga target ang piho nga mga lugar sa punoan sa agianan sa hangin.
Sa diha nga ang mga partikulo ihatod ngadto sa lawas, sila lisud nga mailhan sa konteksto sa komplikado nga paglihok nga tisyu sa lawas, apan ang ilang kapabilidad sa pag-ila napauswag pinaagi sa paglihok sa magnet nga pahalang ibabaw sa trachea aron "pag-uyog" ang mga kuwerdas sa MP.Samtang posible ang real-time nga imaging, mas sayon ​​ang pag-ila sa lihok sa partikulo human ang mananap nga tawhanon nga gipatay.Ang mga konsentrasyon sa MP kasagaran labing taas sa kini nga lokasyon kung ang magnet gipahimutang sa ibabaw sa lugar sa imaging, bisan kung ang pipila ka mga partikulo kasagarang makit-an sa ubos sa trachea.Dili sama sa mga pagtuon sa vitro, ang mga partikulo dili maguyod sa trachea pinaagi sa paglihok sa usa ka magnet.Kini nga pagpangita nahiuyon kung giunsa ang mucus nga nagtabon sa nawong sa trachea kasagarang nagproseso sa mga inhaled nga partikulo, natanggong kini sa mucus ug pagkahuman gilimpyohan kini pinaagi sa mekanismo sa muco-ciliary clearance.
Gipanghimatuud namo nga ang paggamit sa mga magnet sa ibabaw ug sa ubos sa trachea alang sa atraksyon (Fig. 3b) mahimong moresulta sa usa ka mas uniporme nga magnetic field, kay sa usa ka magnetic field nga nagkonsentrar pag-ayo sa usa ka punto, nga posibleng moresulta sa mas uniporme nga pag-apod-apod sa mga partikulo..Bisan pa, ang among pasiuna nga pagtuon wala makit-an nga tin-aw nga ebidensya aron suportahan kini nga hypothesis.Sa samang paagi, ang pagbutang sa usa ka parisan sa mga magnet aron ma-repulse (Fig. 3c) wala magresulta sa dugang nga partikulo sa paghusay sa lugar sa imahe.Kining duha ka mga kaplag nagpakita nga ang dual-magnet setup dili makapauswag sa lokal nga kontrol sa MP pointing, ug nga ang resulta nga kusog nga magnetic forces lisud i-tune, nga naghimo niini nga pamaagi nga dili kaayo praktikal.Sa susama, ang pag-orient sa magnet sa ibabaw ug tabok sa trachea (Figure 3d) wala usab makadugang sa gidaghanon sa mga partikulo nga nahabilin sa gilarawan nga lugar.Ang pipila niini nga mga alternatibo nga mga pag-configure mahimong dili magmalampuson tungod kay kini moresulta sa pagkunhod sa kusog sa magnetic field sa deposition zone.Busa, ang single magnet configuration sa 30 degrees (Fig. 3a) gikonsiderar nga pinakasimple ug labing episyente sa vivo testing method.
Gipakita sa pagtuon sa LV-MP nga kung ang mga vector sa LV gikombinar sa CombiMag ug gihatud pagkahuman sa pisikal nga pagkadisturbo sa presensya sa usa ka magnetic field, ang lebel sa transduction miuswag pag-ayo sa trachea kumpara sa mga kontrol.Base sa mga pagtuon sa synchrotron imaging ug mga resulta sa LacZ, ang magnetic field nagpakita nga makahimo sa pagpabilin sa LV sa trachea ug pagpakunhod sa gidaghanon sa mga partikulo sa vector nga mituhop dayon ngadto sa baga.Ang ingon nga mga pag-uswag sa pag-target mahimong mosangput sa mas taas nga kahusayan samtang ang pagkunhod sa gihatag nga mga titer, dili target nga transduction, makapahubag ug immune nga epekto, ug mga gasto sa pagbalhin sa gene.Importante, sumala sa tiggama, ang CombiMag mahimong gamiton sa kombinasyon sa ubang mga pamaagi sa pagbalhin sa gene, lakip ang ubang mga viral vectors (sama sa AAV) ug nucleic acid.